用于檢測BRAF基因V600E突變的引物、探針、試劑盒及方法技術

本發(fā)明專利技術提供了一種基于實時熒光定量PCR技術平臺的BRAF基因突變檢測的引物、探針、試劑盒及方法，用于檢測BRAF基因V600E突變。本發(fā)明專利技術快速、成本低，具有臨床檢測推廣價值。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫(yī)學臨床分子檢測領域，具體涉及用于檢測BRAF基因V600E突變的引物、探針、試劑盒及其使用方法。
技術介紹
BRAF基因是一種癌基因，與ARAF和RAFl(CRAF)基因同屬于RAF家族，其編碼的BRAF蛋白是一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號通路中的重要轉導因子，參與細胞內多種生物學事件的調控，如細胞生長、分化和凋亡等。 BRAF基因位于7q34，長約190kb，轉錄mRNA長2. 5kb，編碼783氨基酸的蛋白，相對分子質量為94000 95000。BRAF蛋白由783個氨基酸組成，功能上從N端到C端為RAS結合區(qū)、富半胱氨酸區(qū)(Cys)、甘氨酸環(huán)(Gloop)和激活區(qū)。在絕大多數組織和細胞類型中，BRAF是MEK/ERK最為關鍵的激活因子。它主要有CR1、CR2和CR33個保守區(qū)。其中CRl區(qū)含RBD區(qū)(RAS蛋白結合區(qū))和富含半胱氨酸區(qū)(Cys) ;CR3區(qū)為激酶結構域，含甘氨酸環(huán)(Gloop)，為ATP結合位點和激活區(qū)，該區(qū)T598和S601兩個位點的磷酸化對BRAF蛋白的激活至關重要，這兩個位點氨基酸的置換將導致激酶持續(xù)性激活。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突變。BRAF突變主要有兩種類型(I). 11%位于Exonll上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等的點突變；(2). 89%的突變發(fā)生在Exonl5上的激活區(qū)，其中約92%位于第1799位點T突變?yōu)锳，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(即V600E)。V600E突變能模擬T598和S601兩個位點的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。BRAF蛋白激活后導致MEK/ERK的激活，通過轉錄物或非轉錄物的方式影響腫瘤進展。因此，及時檢測BRAF突變情況，對早期篩查腫瘤病人以及對腫瘤個體化治療、預后將具有重要的指導意義。多年來，國內外對BRAF基因突變進行檢測大多采用DNA直接測序法。由于測序法的靈敏度只能檢測低至20%含量的突變，由于腫瘤組織取材及腫瘤細胞突變發(fā)生率的不同，導致測序法往往不能檢出BRAF突變，造成假陰性的結果。另外，測序過程周期長、通量較低，亦不適用于大量人群的快速篩選，難以實現(xiàn)大規(guī)模推廣。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術針對現(xiàn)有技術檢測BRAF基因突變時靈敏度低、周期長、數據分析過程繁瑣等不足，提供了一種基于實時熒光定量PCR技術平臺的BRAF基因突變檢測的引物、探針、試劑盒及方法，用于檢測BRAF基因V600E突變，本專利技術快速、成本低，具有臨床檢測推廣價值。為達到上述目的，本專利技術采用的技術方案是 一種用于檢測BRAF基因V600E突變的引物與探針，其特征在于所述檢測引物及探針根據BRAF基因V600E突變位點設計，序列如下所示檢測正向引物:5，- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA _3，；( SEQ ID No. I)檢測反向引物5’ - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3，； ( SEQ ID No. 2) 檢測熒光探針5’熒光基團-TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’淬滅基團(SEQ IDNo. 3)。本發(fā) 明還提供了一種用于檢測BRAF基因V600E突變的內控引物及內控熒光探針，其特征在于所述內控引物及探針根據GAPDH基因保守序列設計，序列如下所示 內控正向引物5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’ ； ( SEQ ID No. 4) 內控反向引物5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’ ； ( SEQ ID No. 5) 內控熒光探針5’熒光基團-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬滅基團(SEQ ID No. 6)。上述檢測BRAF基因V600E突變的探針及內控熒光探針5’端的熒光基團為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光報告基團，優(yōu)選FAM，TET，VIC，HEX或R0X，3’端的淬滅基團為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光淬滅基團，優(yōu)選BHQ -UBHQ _2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更優(yōu)選的方案為檢測熒光探針的5’端連有的熒光基團為FAM，3’端連有的淬滅基團為Dabcyl ;內控熒光探針的5’端連有的熒光基團為R0X，3’端連有的淬滅基團為 BHQ-2。本專利技術還提供了一種用于檢測BRAF基因V600E突變的熒光PCR試劑盒，包括本專利技術上述檢測BRAF基因V600E突變的檢測引物和相應的熒光探針和使用說明書。具體的說，包含檢測BRAF基因V600E突變的突變特異性PCR反應液，PCR反應液包含了 PCR反應必須的緩沖液、鎂離子、dNTP等物質外，還包含上述檢測引物與探針。上述突變特異性檢測的PCR反應液包含的檢測引物與探針的序列如下 檢測正向引物5’ - AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’ ； 檢測反向引物5’ - CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’ ； 檢測熒光探針5’熒光基團-TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’淬滅基團。上述試劑盒的突變特異性PCR反應液優(yōu)選方案中，除了包括檢測BRAF基因V600E突變的檢測引物和相應的熒光探針外，還包括一對內控引物及相應熒光探針，內控引物與內控探針的序列如下 內控正向引物5’ -CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’ ； 內控反向引物5’ -CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’ ； 內控熒光探針5’熒光基團-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬滅基團。上述試劑盒中檢測BRAF基因V600E突變的探針以及內控熒光探針5’端的熒光基團可以為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光報告基團，優(yōu)選FAM，TET, VIC, HEX或R0X，3’端的淬滅基團為適用于熒光PCR定量分析的常規(guī)使用的熒光淬滅基團，優(yōu)選BHQ-I、BHQ -2、DabcyU Eclipse或TAMRA，更優(yōu)選的方案為檢測熒光探針的5’端連有的熒光基團為FAM，3’端連有的淬滅基團為Dabcyl ;內控熒光探針的5’端連有的熒光基團為R0X，3’端連有的淬滅基團為BHQ-2。上述試劑盒使用說明書包含對PCR擴增條件的描述，優(yōu)選的PCR擴增條件為預變性的條件為溫度為95°C，時間為3分鐘； PCR反應由第一階段和第二階段構成 第一階段由10次擴增循環(huán)構成，其條件為 變性溫度為95°c，時間為20秒；退火起始溫度為56°C，時間為30秒； 延伸溫度為65°C，時間為45秒； 第二階段由30次擴增循環(huán)構成，其條件為 變性溫度為95°C，時間為20秒； 退火溫度為56°C，時間為30秒；(設置熒光信號采集) 延伸溫度為65°C，時間為45秒。本專利技術還提供了一種利用上述引物和熒光探針或者含有上述引物和探針的熒光PCR試劑盒進行檢測BRAF基因V600E突變的方法，步驟包括 (O 引物和探針的設計根據美國國立生物技術信息中心NCBI的核酸序列數據庫 Gen本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測BRAF基因V600E突變的引物與探針,？其特征在于所述檢測引物及探針根據BRAF基因V600E突變位點設計，序列如下所示：？檢測正向引物：5’？？AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA？？3’；檢測反向引物：5’？？CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC？？3’；檢測熒光探針：5’熒光基團？？TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT？？3’淬滅基團。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：王進，趙小龍，何曉輝，劉喬，陳允斌，
申請(專利權)人：蘇州曠遠生物分子技術有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：