一種一步法提取純化核酸的方法技術

本發(fā)明專利技術屬于生物醫(yī)學臨床分子檢測領域，具體涉及一種應用于樣本核酸提取純化并使用于熒光PCR平臺的多重逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測試劑的提取純化液及其應用。其特征在于所述提出方法包含氫氧化鈉和硫酸銨，整個操作流程無需加熱過程。本發(fā)明專利技術實現(xiàn)了常溫下提取并純化樣本中的核酸，并使其能夠滿足核酸檢測的要求。近年來，基因檢測對于病原體的篩查和指導個體化用藥有著非常重要的意義。血液樣本基因組DNA的提取與純化對檢測結果至關重要。本發(fā)明專利技術實現(xiàn)了在常溫下直接提取樣本核酸，極大的簡化了提取流程，值得推廣。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種一步法提取純化核酸的方法
本專利技術屬于生物醫(yī)學臨床分子檢測領域，具體涉及用于一步法提取純化核酸的方法。
技術介紹
藥物體內代謝、轉運及作用靶點基因的遺傳變異及其表達水平的變化可以影響藥物在體內的有效濃度和個體對藥物的敏感性，最終導致藥物的個體差異化反應。隨著分子生物學、基因組學和藥物基因組學的發(fā)展，越來越多的藥物基因組生物標記與藥物個體差異化反應間的關系被闡明。藥物基因組學已成為個體化用藥、評估藥效和藥物不良反應發(fā)生風險、指導和評估新藥研發(fā)的重要工具，部分上市新藥、特別是靶向藥僅限于特定基因型的適應癥患者。因此，對患者進行藥物相關的基因型檢測已經(jīng)越來越頻繁和重要。基因型檢測方法有很多種，例如測序法、基于taqman的SNP分型檢測、核酸雜交法等，且隨著生物技術的不斷發(fā)展，更精準、快捷的方法如雨后春筍般的冒出。目前，大部分方法都是基于核酸擴增后進行基因型檢測的，因此，快捷的獲取高質量的核酸作為擴增反應的模板至關重要。一方面，隨著檢測速度的提升，傳統(tǒng)耗時的核酸提取和純化已經(jīng)成為整個檢測過程的限速步驟，另一方面，傳統(tǒng)的核酸提取純化方法步驟繁多，容易出錯和出現(xiàn)交差污染?，F(xiàn)在，提取純化核酸的方法主要有硅膠膜純化法、磁珠法、纖維素吸附法等，這些方法普遍存在成本高、操作繁瑣、提取流程長、易交叉污染等問題。本專利技術針對現(xiàn)有核酸提取和純化方法普遍存在的問題，提供了一種一步法快速提取純化樣本核酸的方法。本方法可以在10-20分鐘內提取和純化樣本中的核酸，且用本方法獲取的核酸可以用于大部分基因型檢測的方法，保證檢測反應的真實性和準確性。本專利技術快速、操作簡便、成本低，具有廣泛推廣價值。為達到上述目的，本專利技術要解決的技術問題是：一步法提取純化核酸。所述方法包含提取試劑盒和提取方法。提取試劑盒為裂解純化液A。裂解純化液A為濃度為0.1M到飽和濃度的硫酸銨[(NH4)2SO4]。優(yōu)選的，裂解純化液A為1M的硫酸銨[(NH4)2SO4]溶液；提取方法為裂解純化液A與樣本一定體積比混勻后，在高溫（85度以上）孵育5分鐘，8000g以上離心2-10分鐘，所得上清即為分離且純化的核酸。1-1000倍稀釋后可用于核酸檢測。優(yōu)選的，裂解純化液A與樣本體積為1：1，優(yōu)選的，孵育溫度設定為90度，優(yōu)選的，離心條件為12000g離心2分鐘，優(yōu)選的，分離純化的核酸可進行10倍稀釋。本專利技術所述技術方案中的有關內容解釋如下。1.本專利技術工作原理：利用高溫裂解細胞、釋放核酸，用硫酸銨沉淀樣本中干擾PCR進行的蛋白質等雜質，從而分離純化核酸。本專利技術針對的樣本，包括血液、唾液、鼻咽拭子、尿液、肺泡灌洗液、痰液等樣本。提取純化的核酸包括DNA和RNA等。2.本專利技術中的高溫是指借由金屬浴、水浴鍋等加熱設備提供的85度以上的孵育溫度。與現(xiàn)有技術相比，本專利技術的有益效果為：實現(xiàn)了一步法提取純化基因組DNA。傳統(tǒng)的硅膠膜或磁珠法需要“裂解，吸附和洗脫”等多步驟操作，這些操作步驟不僅繁瑣耗時，容易出錯，且多次開蓋，更容易導致交叉污染。本方法將所有操作合在一管中進行，僅需加一次試劑，無需多次開蓋，避免了繁瑣操作和交叉污染，同時節(jié)約了大量時間。實施例1.臨床樣本為靜脈采集的EDTA抗凝血。提取的基因組DNA以蘇州曠遠生物分子技術有限公司產(chǎn)品《人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒（熒光PCR法）》檢測基因型。為了監(jiān)測提取試劑的有效性，在檢測體系內平行的加入用蘇州曠遠生物分子技術有限公司產(chǎn)品《核酸提取純化試劑盒》提取的基因組DNA作為模板進行檢測，比對結果：實施例2.提取試劑的制備配制一定濃度的硫酸銨作為裂解純化液A；提取方法：吸取25微升EDTA抗凝血，加入25微升裂解純化液A，90度孵育5分鐘，12000g,離心2分鐘，上清即為分離純化的基因組DNA，經(jīng)純凈水10倍稀釋后用于PCR檢測。平行對照基因組DNA嚴格按照說明書提取。實施例3：熒光PCR檢測人MTHFR基因多態(tài)性的準備第一步：按照《人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒（熒光PCR法）》說明書配制PCR反應液（表1）：表1.PCR反應體系組成ddH2O加至25μlPCR反應液2.5μlDNA聚合酶（5.0U/μl）0.5μl基因組DNA2μl上述PCR反應液采用實施例2制備的基因組DNA；第二步：上機檢測按照下表設置溫度循環(huán)及信號采集程序；表3.PCR反應程序注：“*”處設置Fam和VIC雙通道采集熒光信號。第四步：分析結果在上述PCR反應體系與溫度循環(huán)程序條件下，比較本方法提取的基因組DNA和用蘇州曠遠生物分子技術有限公司產(chǎn)品《核酸提取純化試劑盒》提取的基因組DNA作為模板的擴增結果，并根據(jù)擴增結果進行基因型判定。結果顯示，兩種方法提取的基因組DNA基因型一致。檢測MTHFR等位基因反應體系內的內控熒光信號均合格，待檢信號也符合試劑盒要求。注意：上述實施例只為說明本專利技術的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本專利技術的內容并據(jù)以實施，并不能以此限制本專利技術的保護范圍。凡根據(jù)本專利技術精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本專利技術的保護范圍之內。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
1.一種一步法提取純化核酸的方法，其特征在于：核酸提取裂解液、純化液應用于樣本核酸提取時，能夠同時滿足樣本核酸的提取和純化和熒光PCR反應的高效率進行。/n

【技術特征摘要】
1.一種一步法提取純化核酸的方法，其特征在于：核酸提取裂解液、純化液應用于樣本核酸提取時，能夠同時滿足樣本核酸的提取和純化和熒光PCR反應的高效率進行。


2.根據(jù)權利要求1所述的核酸提取裂解液，其特征在于所述核酸純化液中硫酸...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：金雅康，韓倩，陳雨婷，吳夢華，王進，
申請(專利權)人：蘇州曠遠生物分子技術有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32