本發明專利技術公開了一種融合基因HSP65-PEAⅠ，它是由結核桿菌熱休克蛋白65的基因和PEA受體結合亞基基因連接制得的融合基因，用該基因表達的融合蛋白HSP65-PEAⅠ在不加任何佐劑的情況下免疫小鼠，3倍LD50劑量PEA天然毒素攻毒，保護率均達到100%，5倍LD50劑量攻毒，保護率均達到80%以上，家兔在三次免疫后，制造三度燒傷多器官功能衰竭動物模型，并人為感染綠膿桿菌PA103菌，免疫實驗組10天內無多器官衰竭癥狀發生并全部存活；融合蛋白HSP65-PEAⅠ作為抗燒燙傷感染多器官衰竭綠膿桿菌毒素疫苗，可用于創燒傷高危作業人員，特別是戰前參戰人員的預防或緊急免疫，預防綠膿桿菌感染，防止創燒傷感染多器官衰竭綜合癥和休克的發生，增加戰場燒燙傷搶救成活率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程及疾病防治領域，具體地涉及一種融合蛋白HSP65-PEA I，以及融合蛋白HSP65-PEA I作為疫苗在防治綠膿桿菌感染，特別是預防燒燙傷感染多器官衰竭、休克中的應用。
技術介紹
燒傷，是重要的戰傷之一。不同國家軍隊，不同對手的戰爭，燒傷比例差別很大。美軍在一、二次世界大戰以及朝鮮戰爭、越南戰爭中，平均燒傷比例為總受傷人數的6%。第三世界國家軍隊由于面對大規模殺傷性武器如凝固汽油彈、白磷彈，燒傷比例要比美軍高的多，可以達到16%。在現代高技術局部戰爭條件下，隨著導彈、貧鈾彈、燃料空氣彈、聯合攻擊彈藥、油氣炸彈、微波武器等高壓高溫高爆性武器的大范圍應用，參戰人員燒傷發生率急劇增加，所以，對燒傷的有效救治，降低嚴重燒傷感染死亡率是戰傷醫學的一項重要任務。燒傷引起傷員的免疫抑制狀態，繼發細菌感染，引起機體敗血癥，在細菌毒素和炎癥反應的雙重作用下，導致多器官衰竭，這是燒傷死亡的主要原因，嚴重燒傷搶救成功與否的關鍵之一是抗感染。其中燒傷感染中綠膿桿菌的感染最為突出和棘手，感染后細菌產生的毒素更是引起傷員休克和多器官衰竭致死的首要原因。戰爭惡劣條件下燒傷后嚴重感染致死形勢則更為嚴峻，尤其是燒傷后感染綠膿桿菌，綠膿桿菌清創后檢出率為2.7%, 20天后檢出率為34.4%，不僅檢出率越來越高，而且抗藥性也越來越強，致使臨床對燒傷感染的治療不能收到理想的效果，死亡率仍然很高。有調查顯示，在燒傷患者中綠膿桿菌的檢出率高居各種感染菌首位。此外，在嚴重呼吸道和泌尿道感染也很常見。綠膿桿菌外毒素A (PEA)是引起傷員死亡的主要原因，識別和結合PEA的受體廣泛存在于人體所有細胞上，可造成人體細胞大范圍死亡，引起組織壞死、器官功能衰竭，最終導致傷員因肺臟、心臟、腎臟、肝臟等多系統器官衰竭(MODS)而死亡。 綠膿桿菌對人和各種動物均具有易感性，屬人獸共患性病原菌，廣泛分布于土壤、水和空氣中，其生態多樣性決定了它的代謝多樣性。該菌屬機會致病菌，常存在于動物和人的皮膚、呼吸道、消化道和泌尿道中，在正常防御能力機體中，綠膿桿菌作為常居菌與宿主共生，成為健康攜帶菌者，而不會發病，只有當宿主防御功能不健全或受損時，這種共生狀態才會發生紊亂，發生異常增殖并具有致病性。嚴重燒傷、外科創傷或術后的免疫虛損宿主、插管治療病人、癌癥、器官移植病人、慢性消耗性疾病、原發或繼發性免疫缺陷病人、中性粒細胞減少癥、HIV、嚴重營養不良造成的免疫功能低下及廣泛應用抗生素者以及新生兒、早產兒等免疫機能不健全者都易發生綠膿桿菌感染，廣泛侵襲機體各個臟器組織，引起各種病變和炎癥，甚至發生敗血癥。在對醫院主要致病菌的調查中顯示，綠膿桿菌位列第三位，僅次于大腸桿菌和克雷伯氏菌。綠膿桿菌感染人主要發生在大面積燒傷后的繼發感染和囊性纖維化患者(CF)，嚴重者可引起全身性敗血癥、腦膜炎或多器官衰竭，一旦發生敗血癥，其死亡率高達44% 81%，多器官衰竭達70%，整體死亡率高達50%。由于綠膿桿菌具有天然耐藥性以及廣譜抗生素的泛濫使用，使得多重耐藥綠膿桿菌感染的情況日益嚴重。綠膿桿菌菌能產生外毒素A (PEA)、內毒素(LPS)、外膜蛋白、纖毛、腸毒素、溶血酶、殺白細胞素、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶及多種胞外S、磷脂酶C (或白細胞素)等致病因子，能廣泛侵襲機體各個臟器組織，引起各種病變和炎癥。菌體崩解后釋放出的內毒素，主要成分為毒力相對較弱的LPS，2 3mg才能致死20g體重小白鼠；另一種毒素為是一種溶血物質:磷脂酶C，它能給入侵的細菌提供營養，增強其毒力，用磷脂酶C注射小白鼠，24小時內可以將小鼠致死。PEA是該菌毒力最強的毒力因子，是一種致死性的外毒素，是其內毒素毒力的I萬倍，PEA注入動物體后，其主要靶器官肝臟會出現細胞腫脹、脂肪變性及壞死性病變；其他臟器病變有肺出血和腎臟壞死等，其中以肝細胞壞死最為嚴重，使肝臟內組織病理學改變，誘導肝細胞凋亡。綠膿桿菌外毒素A是綠膿桿菌的代謝產物，是一種熱不穩定單鏈多肽分子，分子量為66KDa，毒力很強，用5 10倍LD50腹腔注射小白鼠可引起白細胞、血小板迅速減少，凝血時間延長，外周血液中消失的血小板沉積于肺中。PEA可用甲醛或戊二醛脫毒使其毒力減弱，作為類毒素防治綠膿桿菌感染的作用。近幾年來，科學家們研究的焦點主要集中在PEA的分子結構與其毒力強弱的關系上，通過基因工程技術對外毒素A基因定點敲除的方式進行改造，研制無毒性或者毒性很弱的突變體，為外毒素疫苗的研究創造了良好的條件。在對PEA的分子結構與作用機制有一定研究的基礎上，利用PEA的細胞毒性作用制成免疫毒素，作為治療癌癥的藥物；人們又利用基因工程技術將其改造為具有醫療用途的蛋白質，利用PEA良好的免疫原性制備基因工程疫苗，防治綠膿桿菌感染；利用PEA的載體蛋白功能，可攜帶外源蛋白或DNA進入細胞中用于基因治療；同時PEA也是優良的疫苗佐劑和疫苗載體，可以大大增強疫苗的免疫原性，然而綠膿桿菌菌株多，毒力差異大，GeneBank已發表的全長 PEA 序列只有三個(AE004091，strainPAOl ；Cp000438, strainUCBpp-PA14 ；K01397 ；strainPA103)，Blast序列比對分析結果顯示，PEA堿基序列與氨基酸序列之間均存在明顯差異。研究不同菌株間PEA堿基序列、分子結構和PEA蛋白生物活性的差異可以很好的揭示PEA結構與細胞毒性及免疫原性的關系，為PEA更好的應用于免疫毒素、疫苗研究和基因治療打下了良好的基礎。綠膿桿菌外毒素A是一種外分泌性蛋白，屬于細菌性ADP核糖基轉移酶家族的一員，它與白喉毒素(DT)，霍亂毒素等一樣。在菌體內以638個氨基酸的前體形式合成，經翻譯加工后分泌至胞外，在氨基末端有25個氨基酸的高度疏水的先導肽，并以酶前體的形式(即檢測不到其ADP-核糖基化活性)分泌到綠膿桿菌的周質空間內，在周質空間內被酶切后成為含有613個氨基酸的成熟毒素蛋白并分泌到細菌細胞外。成熟的PEA是由613個氨基酸組成，分子量是66.58KD，等電點是5.0,由三個結構域組成，當在酸性條件下時，由于毒素蛋白結構會受PH影響而伸長，使得酶切位點暴露出來，而能夠被蛋白酶進行酶切，酶切后的部分包含第三結構域部分因為空間結構改變使得核糖基轉移活性區域暴露而具有核糖基轉移酶的活性，來催化NAD+和真核蛋白延長因子-2 (EF-2)的核糖基化反應。在體內只有PEA進入動物細胞漿后才有活性，而在體外則需經過尿素(4.0mol/L)或二巰基乙醇(1%)處理后才能檢測到活性。PEA的編碼結構基因經測定位于細菌染色體上，是單一順反子。經X射線衍射晶體可知:PEA含有三個不同的結構域(Domain,D),即Domain I (受體結合區)、Domain II (跨膜區)和Domain III (催化區)。其中Domain I又包含Domain Ia和Domain Ib兩部分，它們在空間結構上靠近，但在一級結構中并不相連。Domain Ia由第I 252位的氨基酸組成,Domain II由第253 364位的氨基酸組成,Domain III由第400 613位的氨基酸組成。Domain I位于PEA分子的氨基端(N端本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種融合蛋白基因HSP65?PEAⅠ，它是由結核桿菌熱休克蛋白65的基因HSP65和PEA受體結合亞基基因PEAⅠ順序連接制得。
【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白基因/，它是由結核桿菌熱休克蛋白65的基因和PEA受體結合亞基基因PEA I順序連接制得。2.根據權利要求1所述的一種融合蛋白基因/，其特征在于:所述的抗PEA抗體受體結合亞基基因產說/，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。3.根據權利要求1或2所述的一種融合蛋白基因/其特征在于:所述的結核桿菌熱休克蛋白65基因57奴^，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。4.根據權利要求1所述的一種融合基因/，其堿基序列如序列表SEQIDN0.3所示。5.一種融合蛋白HSP65-PEA I，它是由權利要求1所述的一種融合基因表達的蛋白。6.根據權利要求5所述的一種融合蛋白HSP65-PEAI ,其特征在于:其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示。7.一種融合蛋白HSP65-PEA I的制備方法，它包括以下步驟: 1)用引物: Fh: GCCCATGGATGGCCAAGACAATTGCGTACGARh:ACGAATTC...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張國利，馮越，朱平，岳玉環，吳廣謀，田園，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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