【技術實現步驟摘要】
TALE重復單元四聚體庫的構建方法、TALEN表達載體的構建方法及其應用
本專利技術屬于基因工程
，涉及一種TALE重復單元四聚體庫的構建方法、TALEN表達載體的構建方法及其應用，具體涉及組裝多個TALE重復序列，同時將組裝的重復序列插入TALEN表達載體的方法，該方法基于Golden Gate克隆技術。
技術介紹
基因組靶向修飾是近年來生命科學研究的熱點之一，特別是在基因治療人類疾病方面，基因組靶向修飾具有廣闊的應用前景。通過轉基因或者基因敲除等操作改變動物基因的遺傳組成，可按人們的意愿對動物進行各種基因改造，獲得滿足各種需要的基因工程動物。當前轉基因動物生產中面臨的最大技術難題是動物基因組中外源基因的插入或特定基因敲除的效率低和精確性差。傳統較常用的轉基因方法為同源重組法和反轉錄病毒攜帶法。但同源重組法成功率低(重組概率為10_6 10_7)，而反轉錄病毒攜帶目的基因的隨機插入法雖效率高，但由于其插入位點的不確定性和對其它內源基因表達的影響，限制了該方法的應用。人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFNs)技術是一種能夠對基因組進行精確定點修飾的技術。ZFN利用了鋅指蛋白特異結合DNA的特性和Fok I核酸酶非特異的DNA切割特性，能夠在靶基因特定位點切割DNA雙鏈，細胞內部DNA斷裂修復機制能夠有效地將含有同源片段的外源基因插入到DNA斷裂處，從而實現高效、定點轉基因，該技術介導的轉基因成功率高達20%。盡管鋅指核酸酶技術的出現促使基因組靶向修飾技術向前邁進了一大步，然而目前對于許多研究者而言設計出高效、高特異性的鋅...
【技術保護點】
TALE重復單元四聚體庫的構建方法，包括下述步驟：(1)、PCR擴增TALE單個重復單元：以TALE單個重復片段monomer?NI為模板，用TALE?F1/TALE?R1為引物PCR擴增得到TALE單體NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE單個重復片段monomer?NG為模板，用TALE?F2/TALE?R2為引物PCR擴增得到TALE單體NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE單個重復片段monomer?HD為模板，用TALE?F3/TALE?R3為引物PCR擴增得到TALE單體HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE單個重復片段monomer?NN為模板，用TALE?F4/TALE?R4為引物PCR擴增得到TALE單體NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer?NI識別A堿基、monomer?NG識別T堿基、monomer?HD識別C堿基、monomer?NN識別G堿基；(2)、將步驟(1)構建所得的TALE單體插入線性化pGEM?T?easy載體中，得到相應的16個TALE單體質粒pGEM?T?NI1、pGEM?T?NI2、pGEM?T?NI3、pGEM?T?...
【技術特征摘要】
1.TALE重復單元四聚體庫的構建方法，包括下述步驟: (1)、PCR擴增TALE單個重復單元:以TALE單個重復片段monomerNI為模板，用TALE-F1/TALE-R1為引物PCR擴增得到TALE單體NI1、NI2、NI3、NI4 ;以TALE單個重復片段monomer NG 為模板，用 TALE-F2/TALE-R2 為引物 PCR擴增得到 TALE 單體NGl、NG2、NG3、NG4 ；以TALE單個重復片段monomer HD為模板，用TALE-F3/TALE-R3為引物PCR擴增得到TALE單體 HD1、HD2、HD3、HD4 ；以 TALE 單個重復片段 monomer NN 為模板，用 TALE-F4/TALE-R4 為引物 PCR 擴增得到 TALE 單體 NN1、NN2、NN3、NN4，其中 monomer NI 識別 A 堿基、monomer NG識別T堿基、monomer HD識別C堿基、monomer NN識別G堿基； (2)、將步驟(I)構建所得的TALE單體插入線性化pGEM-Teasy載體中，得到相應的 16 個 TALE 單體質粒 pGEM-T-NIl、pGEM_T_NI2、pGEM_T_NI3、pGEM_T_NI4、pGEM-T-NGl、PGEM-T-NG2、pGEM_T_NG3、pGEM_T_NG4、pGEM-T-HD1、pGEM_T_HD2、pGEM_T_HD3、pGEM_T_HD4、pGEM-T-剛1、pGEM-T-剛2、pGEM_T_NN3 和 pGEM_T_剛4 ； (3)、在T4DNA連接酶緩沖液中加入TALE單體質粒，同時加入BsaI內切酶和T4DNALigase進行酶切-連接反應，所述TALE單體質粒為pGEMT-Momomerl，pGEMT-Monomer2, pGEMT_Monomer3 和 pGEMT_Monomer4,得到含 256 個四聚體質粒的 TALE重復單元四聚體庫，其中 pGEMT-Momomerl 為 pGEM-T-NIl、pGEM-T-HDl、pGEM-T-NGl 或pGEM-T-NNl 中的一個，pGEMT-Monomer2 為 pGEM_T_NI2、pGEM_T_HD2、pGEM_T_NG2 或PGEM-T-NN2 中的一個，pGEMT-Monomer3 為 pGEM_T_NI3、pGEM_T_HD3、pGEM_T_NG3 或PGEM-T-NN3 中的一個，pGEMT_Monomer4 為 pGEM_T_NI4、pGEM_T_HD4、pGEM_T_NG4 或pGEM-T-NM 中的一個。2.根據權利要求1所述的TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，步驟(I)中PCR擴增的體系為模板I μ L、正向引物I μ L、反向引物IyLUOXTaq Buffer 5 μ L、.2.5mmol/L dNTPs 4 μ L, Taq DNApolymerase 0.5 μ L 和 H2O 37.5 μ L ;PCR 擴增的反應條件為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，54。。退火30s，72。。延伸40s，擴增30個循環；72°C延伸 IOmin03.根據權利要求1所述的 TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中TALE單體插入線性化pGEM-T easy載體中的具體步驟為TALE單體與末端含T堿基的線性化pGEM-T easy載體連接，連接體系為線性化pGEM_T easy載體I μ L、TALE單體I μ L、10 X T4DNA 酶 Buffer I μ L、T4 連接酶 I μ L 和 H2O 6 μ L。4.根據權利要求1所述的TALE重復單元四聚體庫的構建方法，其特征在于，步驟(3)中的酶切-連接反應體系為 pGEMT-Momomerl2 μ L、pGEMT-Momomer22 μ L、pGEMT-Momomer32 μ L、pGEMT_Momomer42 μ L、10 X T4DNA 酶 Buffer 2 μ L、BsaI 0.5 μ L、T4連接酶 0.5μ I^PH2O 9μ L ;反應條件為首先 37°C 5min，16°C 5min，循環 30 次；16°C IOh ；.65 °C 20min。5.TALEN表達載體的構建方法，包括權利要求1-4中所述的TALE重復單元四聚體庫的構建過程，該TALEN表達載體的構建方法還包括下述步驟: (A)、將含14個堿基的靶向序列中由TALEN骨架載體N端決定的第一個T堿基和.0.5個重復單元決定的最后一個堿基之間的12個堿基序列按照從N端到C端的順序分成NNNN(l-4)、NNNN(5-8)和NNNN(9_12)三個堿基組，從權利要求1_4中所述方法構建的TALE重復單元四聚體庫中篩選與堿基組對應的pGEM-T-NNNN(l-4)、pGEM-T-NNNN(5-8)和pGEM-T-NNNN(9-12)，其中 N 為 A、T、C 或 G 中的一種； (B)、以pGEM-T-NNNN (1-4)為模板，用 Tetramer-Fl/Tetramer-Rl 引物對進行 PCR 擴增，得到片段 TALE-NNNN (1-4) ; WpGEM-T-NNNN (5-8)為模板，用 Tetramer_F2/Tetramer-R2引物對進行PCR擴增，得到片段TALE-NNNN (5-8)；以pGEM-T-NNNN (9-12)為模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3 引物對進行 PCR 擴增，得到片段 TALE_NNNN(9_12)； (C)、以pLent1-EFIa-Backbone (N13)為模板，以 TAL-N-F/TAL-C-R 為引物 PCR 擴增，擴增產物經XbaI和BamHI雙酶切后與同樣經XbaI和BamHI雙酶切的pST1374載體進行連接，得到TALE...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張智英，張志強，李鐸，辛穎，麻麗霞，王昕，張濤，徐華榮，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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