一種敲除牛MSTN基因的打靶載體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體PIII-MSTN，其可敲除牛MSTN基因第一、二外顯子的全部和第三外顯子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；PIII-MSTN核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3，包含長約1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、無啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因EGFP和自身帶有啟動(dòng)子PGK的新霉素抗性基因Neor表達(dá)框架。本發(fā)明專利技術(shù)的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體PIII-MSTN可用于培育敲除了MSTN基因的轉(zhuǎn)基因肉用牛。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)及生物
，涉及一種啟動(dòng)子捕獲型打靶載體，具體地，涉及一種敲除牛MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
肌肉生長抑制素(MSTN)是特異性骨骼肌生長發(fā)育負(fù)調(diào)控因子，其活性的喪失或降低，會(huì)引起動(dòng)物肌肉的過度發(fā)育，牛MSTN基因的自然突變會(huì)引發(fā)“雙肌”現(xiàn)象。雙肌牛比正常牛具有較高的瘦肉率和較好的肉質(zhì)，且脂肪率低，口感良好，但國內(nèi)現(xiàn)有品種中缺少“雙肌”表型的牛。通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建了 MSTN基因突變純合體小鼠，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了生長抑素基因突變鼠的體重比正常鼠大30%，而且這種差異在成年鼠中不受年齡和性別的影響(McPherron A C, 1997, Nature 387,83-90)。以雙肌現(xiàn)象著稱的比利時(shí)藍(lán)牛(BelgianBlue)和皮德蒙特牛(piedmontese)就是MSTN基因發(fā)生自然突變。比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因序列中的第3個(gè)外顯子上缺失了 11個(gè)核苷酸，是導(dǎo)致MSTN基因閱讀框發(fā)生移位，使MSTN被截短，不能發(fā)揮其生物的活性；皮爾蒙特牛則是由于第3個(gè)外顯子發(fā)生了錯(cuò)誤突變，導(dǎo)致了在成熟蛋白區(qū)內(nèi)酪氨酸代替了保守的半胱氨酸，而在第I個(gè)外顯子也發(fā)生了突變，造苯丙氨酸代替了亮氨酸，起結(jié)果均使肌肉生成抑制素的功能全部或者幾乎全部喪失(KambadurR，1997，Genome Res 7 (9),910-916) MSTN基因的發(fā)現(xiàn)，為生物育種工作者提供了新的思路。但是，育種工作者利用現(xiàn)有的雙肌動(dòng)物進(jìn)行繁育存在育種速度慢和雜交性狀不穩(wěn)定等問題。2000年，McCreath等利用體外培養(yǎng)的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行COLlAl基因的定點(diǎn)突變，并利用定點(diǎn)突變成功的細(xì)胞作為體細(xì)胞克隆的核供體，已經(jīng)成功獲得基因定點(diǎn)修飾的活的小羊，這為家畜類動(dòng)物的基因修飾提供了有效的途徑(McCreath，2000，Nature 405，1066-1069)。另外，研究表明，在體細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶，啟動(dòng)子捕獲型打靶載體的效率比傳統(tǒng)的有啟動(dòng)子打靶載體聯(lián)合正負(fù)篩選策略的效率高出 100 倍左右(ffaldman A S，1992，Crit Rev Oncol Hematol 22(1)，127-128)。目前，在家畜MSTN基因敲除研究方面，國內(nèi)外在載體構(gòu)建方面做了大量的研究工作，獲得了一些MSTN基因敲除細(xì)胞系。但動(dòng)物出生的報(bào)道相對(duì)較少，其中利用啟動(dòng)子捕獲型載體進(jìn)行MSTN基因突變的就更加罕見。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體；本專利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供該啟動(dòng)子捕獲型打靶載體的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案是從和牛耳部組織中提取牛的基因組DNA，根據(jù)Genebank報(bào)道的牛MSTN基因序列設(shè)計(jì)長短同源臂引物，通過PCR方法從基因組DNA中克隆同源臂，將同源臂分別克隆到表達(dá)載體，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和測序分析確定同源臂的準(zhǔn)確性后，采用酶切和連接的方法將長短同源臂分別連接到基礎(chǔ)載體PIII中，最后通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定同源臂連接的正確性，構(gòu)建獲得一種敲除牛MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體PII1-MSTN(構(gòu)建過程參見圖1)。MSTN基因的核苷酸序列在進(jìn)化過程中高度保守，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中第三個(gè)外顯子是它的成熟區(qū)；牛的MSTN基因位于2號(hào)染色體的近著絲粒端距離TGLA44(微衛(wèi)星標(biāo)記，ms) 3.1cM的位置，包括6691個(gè)堿基，3個(gè)外顯子分別位于10134 10506、12335 12708和14741 15121位置上。基礎(chǔ)載體PIII包含一個(gè)不含啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白EGFP基因和一個(gè)含自身啟動(dòng)子PGK的新霉素抗性基因(Neolr)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本專利技術(shù)提供的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體為PII1-MSTN，包含MSTN基因長短同源臂3’同源臂和5’同源臂，PII1-MSTN載體中的MSTN基因同源臂序列能夠靶向性界定并敲除基因組上的靶基因。所述的5’同源臂不包含MSTN基因自身啟動(dòng)子的全部序列，且最后一個(gè)堿基為MSTN第一外顯子起始密碼子上游最后一個(gè)堿基。所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 的 15091 21957。打靶載體PII1-MSTN可敲除牛MSTN基因第一、二外顯子的全部和第三外顯子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；PII1-MSTN核苷酸序列如SEQ ID N0:3，包含長約1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、無啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因EGFP和自身帶有啟動(dòng)子PGK的新霉素抗性基因Neolr表達(dá)框架。當(dāng)打靶載體與靶基因序列發(fā)生同源重組時(shí)，通過表達(dá)標(biāo)記基因，從而確定PII1-MSTN載體中的MSTN基因同源臂序列靶向性界定并敲除基因組上的靶基因。本專利技術(shù)用于擴(kuò)增上述MSTN基因同源臂的引物，分別包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的兩組PCR引物對(duì)。本專利技術(shù)提供了用 PCR方法擴(kuò)增牛MSTN基因同源臂的具體引物:5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC,5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ；3’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT,3’同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA,下劃線部分為酶切位點(diǎn)。本專利技術(shù)提供一種構(gòu)建敲除MSTN基因啟動(dòng)子捕獲型打靶載體的方法，包括如下步驟:I)提取牛組織基因組DNA ；2)利用上述引物用PCR方法從步驟I)的基因組DNA中克隆MSTN基因的長短同源臂，分別為3’同源臂和5’同源臂；3)將同源臂克隆到表達(dá)載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶和測序分析進(jìn)行鑒定；4)將鑒定正確的同源臂連接到基礎(chǔ)載體PIII中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，構(gòu)建得到敲除牛MSTN基因的打靶載體。其中步驟2)所述的PCR方法擴(kuò)增5’同源臂，其反應(yīng)條件為:95°C變性50s，60°C復(fù)性50s，72°C延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；所述的PCR方法擴(kuò)增3’同源臂，其反應(yīng)條件為:95°C變性50s，59。。復(fù)性50s，72。。延伸7min，共35個(gè)循環(huán)。G418 (Geneticin selective antibiotic 418)是一種抗生素類藥物，當(dāng) Neor 基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。本專利技術(shù)還提供一種敲除牛MSTN基因的方法，利用電轉(zhuǎn)染的方法將打靶載體導(dǎo)入牛胎兒(50天胎齡)成纖維細(xì)胞中，根據(jù)置換型打靶載體的原理，如圖2中打靶載體PII1-MSTN的同源臂序列N5mstn和N3mstn分別與野生型MSTN基因發(fā)生交換，獲得中靶后MSTN基因序列，即MSTN基因的第一外顯子和第二外顯子的全部以及第三外顯子的大部分被從基因組內(nèi)置換掉，而取代它的是綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因。發(fā)生正確本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動(dòng)子捕獲型打靶載體。2.按權(quán)利要求1所述的打靶載體，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一個(gè)堿基為MSTN第一外顯子起始密碼子上游最后一個(gè)堿基，在同源臂之間還具有標(biāo)記基因。3.按權(quán)利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO:1的15091 21957。4.按權(quán)利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述標(biāo)記基因包括報(bào)告基因EGFP和帶有啟動(dòng)子PGK的新霉素抗性選擇基因Nec/。5.按權(quán)利要求1 4之一所述的打靶載體，其為PII1-MSTN，質(zhì)粒圖譜如圖1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3o6.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1 5之一所述的打靶載體中MSTN基因同源臂的引物，其分別包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的兩組PCR引物對(duì)。7.按權(quán)利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物為: 5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC, 5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ； 3 ’ 同源臂上游引物:GATC...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李榮鳳，趙麗華，李雪玲，梁浩，云亭，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：內(nèi)蒙古大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：