分泌表達抗菌肽Metchnikowin大腸桿菌基因工程菌的構建方法技術

本發明專利技術公開了一種構建上述分泌表達抗菌肽Metchnikowin大腸桿菌基因工程菌的方法，包括將抗菌肽Metchnikowin基因連接，構建重組pET-22b質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。本發明專利技術的有益效果在于，高效穩定的分泌表達，下游DP水解位點使得切割蛋白成本低，更安全。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種。
技術介紹
抗菌肽是在誘導條件下，生物體免疫防衛系統產生的小分子活性肽類，廣泛分布于植物，動物以及人類。抗菌肽是由基因編碼、由核糖體合成的。目前已經發現、鑒定的抗菌肽已超過千種，大多帶凈正電荷。從結構上看可以分為α-螺旋型、折疊型、富含二硫鍵的、富含脯氨酸等多種類型。抗菌肽抑菌譜廣，有些抗菌肽還可以特異性地抑制某些腫瘤細胞的生長。抗菌肽可以用于醫藥衛生、食品添加劑、飼料添加劑等方面。抗菌肽與傳統抗生素抑菌機理不同，抗菌肽的作用方式主要是選擇性地攻擊病原物的細胞膜，相應地病原物不易產生針對抗菌肽的耐藥性，因此使用抗菌肽可以解決細菌耐藥性問題。同時又由于它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對人體無害，無殘留，因此，抗菌肽在醫藥、畜牧業、農業等方面都有十分廣泛的應用前景。抗菌肽在生物體內含量極低，生產成本居高不下，嚴重影響其廣泛應用；研究開發其大規模生產方法具有十分積極的意義。目前，生產抗菌肽的方法主要有三種:1.直接從生物體中提取天然抗菌肽:抗菌肽廣泛存在于低等到高等動物的特定組織中，但是含量非常少，且提取工藝復雜，成本昂貴，難以滿足大規模生產的要求；2.化學方法合成抗菌肽:化學合成法成本高，同時難以保證合成肽類的天然結構和生物活性；3基因工程方法:采用該方法是如今研究的熱點，也是獲得抗菌肽的有效途徑之一。Metchnikowin是一種富含脯氨酸的小肽。含脯氨酸抗菌肽的作用機制，一般認為是直接穿過細菌細胞膜，進入細胞后與細胞內的生物大分子例如核酸分子相互作用，從而達到殺菌抑菌的效果。大多 數此類含脯氨酸抗菌肽主要針對革蘭氏陰性菌，但來源于果蠅的Metchnikowin卻主要針對革蘭氏陽性菌以及真菌起作用。由于在體內，不同結構特點的抗菌肽是相互配合發揮作用的，因此相應地需要在體外對不同抗菌肽進行研究。目前對于含脯氨酸抗菌肽的重組表達報道不多，Metchnikowin的重組表達也未見報道。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種。本專利技術是通過以下技術方案來實現的。一種構建上述分泌表達抗菌肽Metchnikowin大腸桿菌基因工程菌的方法，包括將抗菌肽Metchnikowin基因和融合基因連接，構建重組pET_22b質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。進一步地，上述抗菌肽Metchnikowin基因含有核苷酸序列SEQ ID:N0 1、SEQ ID:N02，含有氨基酸序列 SEQ ID N03:SEQ ID N04。進一步地，上述抗菌肽Metchnikowin基因是通過擴增獲得的，以含有Metchnikowin基因序列的質粒為模板,在其下游設計EcoRI酶切位點,其引物為:MF: 5 ’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3，;MR: 5，-GGAATTCTTAATAAATCGG -3，。進一步地，上述融 合基因的擴增，以含有融合蛋白基因的質粒為模板，在序列上游設計Nco I酶切位點，其引物:CF:5，-CATGCCATGGATCACCATCATCATCAT-3，;CR: 5’-AAGGGTTTCCGAAGGCTTGG-3’。進一步地，上述構建重組pET_22b質粒中，以上述擴增的融合蛋白基因與上述擴增的抗菌肽Metchnikowin基因磷酸化后用T4DNA連接酶連接。進一步地，上述誘導表達:振蕩培養基因工程菌至對數期，加入誘導劑誘導24小時，培養溫度:25°C。本專利技術的有益效果:高效穩定的分泌表達，下游DP水解位點使得切割蛋白成本低，更安全。附圖說明圖1為本專利技術的電泳結果示意圖；圖2為本專利技術的活性示意圖。具體實施例方式下面根據附圖和實施例對本專利技術作進一步詳細說明。1、基因擴增:(1) Metchnikowin基因的擴增:以含有Metchnikowin基因序列的質粒為模板，在其下游設計EcoRI酶切位點，引物MF:5’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3，; MR:5’-GGAATTCTTAATAAATCGG _3’，反應條件:94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30 個循環，72°CIOmin0反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。(2)融合蛋白基因的擴增:以含有融合蛋白基因的質粒為模板，在序列上游設計 Nco I 酶切位點，引物:CF:5’ -CATGCCATGGATCACCATCATCATCAT-3，，CR::5’ -AAGGGTTTCCGAAGGCTTGG-3’。反應條件:94°C45s, 50°C 45s，72°C 30s，30 個循環，72°C IOmin0 反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠回收試劑盒回收。(3) Metchnikowin基因和融合蛋白的鏈接:將Metchnikowin基因PCR產物和融合蛋白基因PCR產物按1:1混合，用T4PNK進行磷酸化后用T4DNA連接酶連接。再使用(I)和(2)中的引物MetchnikowinF和引物CR進行PCR擴增，反應條件:94°C 45s, 50°C 45s, 72°C 30s，30個循環，72°C IOmin0反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。2、克隆轉化:PCR產物和載體均用EcoRI和NcoI酶切，產物經純化后用T4DNA連接酶連接得到重組質粒1:pET-22b- MetchnikowinC,轉化BL21 (DE3)感受態細胞,氨節青霉素篩選陽性克隆，少量提取質粒，并測序。3、誘導表達:將含有重組質粒I的工程菌接種至含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養基中37°C過夜振蕩培養，按1%量接入新鮮的LB培養基，37°C振蕩培養至0D600 ^ 0.5時,加入終濃度lmmol/L的IPTG,25°C誘導24h, 9000r/min離心lmin,收集上清液。4、化學切割和純化取20ml上清液，緩慢滴加50%的乙酸溶液直至溶液pH=2.5。密閉容器，至于50攝氏度水浴內恒溫72小時，12000 r/min離心lOmin，得到含Metchnikowin上清液，采用陽離子交換層析，純化Metchnikowin。上述實施例只為說明本專利技術的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本
技術實現思路
并加以實施，并不能以此限制本專利技術的保護范圍。凡根據本專利技術精神實質所作的等效變化或 修飾，都應涵蓋在本專利技術的保護范圍內。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種構建所述分泌表達抗菌肽Metchnikowin大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括將抗菌肽Metchnikowin基因連接，構建重組pET?22b質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。

【技術特征摘要】
1.一種構建所述分泌表達抗菌肽Metchnikowin大腸桿菌基因工程菌的方法,其特征在于，包括將抗菌肽Metchnikowin基因連接，構建重組pET_22b質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述抗菌肽Metchnikowin基因含有核苷酸序列 SEQ ID:N0 1、SEQ ID:N02，含有氨基酸序列 SEQ ID N03:SEQ ID N04。3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述抗菌肽Metchnikowin基因是通過擴增獲得的，以含有Metchnikowin基因序列的質粒為模板,在其下游設計EcoRI酶切位點，其引物為:MF:5’ -CATCGTCATCAGGGTCCG-3’ ;MR:5，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：查向東，惲輝，余忠麗，程林春，趙大偉，耿玉靜，
申請(專利權)人：安徽希普生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：