于細胞內制造融合蛋白質的方法技術

本發明專利技術涉及一種于細胞內制造融合蛋白質的方法。根據本發明專利技術，提出一種融合蛋白質的制造方法，系包括下列步驟：構筑一編碼一錨定區域及一第一目標勝肽的第一核酸分子；構筑一編碼一黏附區域及一第二目標勝肽的第二核酸分子；遞送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主細胞內；及培養宿主細胞，以表現一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且第一融合勝肽具有錨定區域及第一目標勝肽，第二融合勝肽具有黏附區域及第二目標勝肽，藉此錨定區域連接于黏附區域，以容許第一融合勝肽及第二融合勝肽相互融合。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術關于一種融合蛋白質的制造方法，且特別是攸關一種。
技術介紹
融合蛋白質(Fusion protein),是指一種連接有至少二個以上多勝肽的蛋白質，可能保有單一多勝肽原有的生物功能，或是呈現不同于單一多勝肽的生物功能。舉例來說，融合有β -半乳糖苷酶(β -galactosidase)及半乳糖去氫酶(galactose dehydrogenase)的蛋白質,經細胞外實驗后,證實其相較于單一酵素具有酵素動力學上的優勢(請參閱 Ljungcrantz. P. , et al. , Biochem. , 1989, 28: 8786-8792)。又舉例來說，融合有海藻糖磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthetase)及海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphate phosphatase)的蛋白質,經細胞外實驗后,證明其不僅保留單一酵素本身的活性外，更較單一酵素具有酵素動力學上的優勢(請參閱Seo H. S.，etal. , Appl. Environ. Microbiol. , 2000, 66: 2484-2490)。再舉例來說，甜菜醒去氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase)-膽喊去氧酶(chloline dehydrogenase)融合蛋白質于大腸桿菌co7i)或煙草OVicotabacum)內表現時，可以提升這些生物體抵抗逆境的能力(請參閱 Yilmaz J. L. , et al. , Biotechnol. Progs. , 2002, 18:1176-1182)。融合蛋白質可以自然存在于細胞體內，例如癌癥細胞中的bcr-abl融合蛋白質。融合蛋白質也可以有目的地透過人為方式存在于細胞體內，基因工程已提供一般實驗流程來實現之，如聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)、限制酶剪切(enzymedigestion)、核酸接合(DNA ligation)、…等等。詳細地說,須將二個以上各自編碼一個多勝肽的基因片段連接在一起，再送入至細胞體內。接著，于細胞體內表現這些多勝肽而形成融合蛋白質。`就基因工程而言，制備融合蛋白質的方法雖然相當簡單，但是融合蛋白質大多屬于大分子，使得其在空間上的彈性度及自由度受到阻礙，且彼此易相互干擾而無法折迭，造成融合蛋白質失去生物活性，甚至于細胞體內形成不可溶的包涵體(inclusion body)。因此，后續須破壞細胞體取得包涵體，再從包涵體得到失活的融合蛋白質，并于適當溶液中使失活的融合蛋白質折迭而復性。但復性過程畢竟系屬人為操作的，仍不比細胞體內提供的環境，因此在溶液中折迭的融合蛋白質的生物功能仍然有改善空間。
技術實現思路
自然界中，厭氧微生物演化出一種相當特殊且可以有效分解纖維素的胞器。厭氧微生物在細胞外形成纖維體(celIulosome),纖維體含有一撐架蛋白質(scaffoldingprotein),而撐架蛋白質具有一黏附區域(coherin domain),黏附區域結合至一纖維素水解酶(cellulase)的錨定區域(dockerin domain),藉此容許纖維體成為一酵素復合體(enzyme complex)而有效地分解纖維素(請參閱 Doi R. H. , et al. , Nature Rev.Microbiol. , 2004，2: 541—551)。本專利技術乃是根據黏附區域結合至錨定區域的特性，而發現二各具有黏附區域及錨定區域的融合蛋白質在同一宿主細胞中被表現，黏附區域及錨定區域不易影響此二融合蛋白質中其它多勝肽的彈性度及自由度，使得此些融合蛋白質可以于宿主細胞內折迭并相互融合，并提供此二融合蛋白質優異的生物功能。因此，在第一方面，本專利技術揭露一種融合蛋白質的制造方法，其包括下列步驟(a)構筑一編碼一錨定區域及一第一目標勝肽的第一核酸分子；(b)構筑一編碼一黏附區域及一第二目標勝肽的第二核酸分子；(C)遞送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主細胞內；以及(d)培養宿主細胞，以表現一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且第一融合勝肽具有錨定區域及第一目標勝肽，第二融合勝肽具有黏附區域及第二目標勝肽，藉此錨定區域連接至黏附區域，以容許第一融合勝肽及第二融合勝肽相互融合。在第二方面，本專利技術揭露一種宿主細胞，其包括一第一核酸分子及一第二核酸分子，而第一核酸分子系編碼一錨定區域及一第一目標勝肽，第二核酸分子系編碼一黏附區域及一第二目標勝肽。附圖說明圖1為質體pETW-A2HCh的圖譜，圖中簡寫符號Ap，抗胺芐青霉素基因；T7promoter, T7 啟動子；AHL,編碼a radiobacter B11291 AHL 的基因；HDT,編碼 Agrobacterium radiobacter B11291 HDT 的基因；ColEl,大腸桿菌的 ColEl 復制起始點。圖2為質體pTH-ChA203的圖譜，圖中簡寫符號Km，抗康那霉素基因；T7promoter, T7 啟動子;AHL，編碼Agro0acten·u/α radiobacter B11291 AHL 的基因；ChBD,編媽Agrobacterium radiobacter WL-12 ChBD 的基因；pSC101,大腸桿菌的 pSClOl 復制起始點。圖3為質體pTH-AL203Coh的圖譜，圖中簡寫符號Km，抗康那霉素基因；T7promoter, T7 啟動子;AHL，編碼Agro0acten·u/α radiobacter B11291 AHL 的基因；CohI,編媽Clostridium黏附區域的基因；pSC101,大腸桿菌的pSClOl復制起始點。圖4為質體pTac-HDTDoCh的圖譜，圖中簡寫符號Ap，抗胺芐青霉素基因；TrxA，編碼 TrxA 的基因；HDT,編碼radiobacter B11291 HDT 的基因；Docl,編碼Clostridium錨定區域的基因；ColEl,大腸桿菌的ColEl復制起始點。圖5為質體pTac-TrChHDT的圖譜，圖中簡寫符號Ap，抗胺芐青霉素基因；Tac，Tac 啟動子；TrxA,編碼 TrxA 的基因；HDT,編碼radiobacter B11291 HDT的基因；ChBD，編碼circulans WL-12 ChBD的基因；ColEl，大腸桿菌的ColEl復制起始點。圖6為非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯酰胺電泳膠圖，以說明重組菌株BL21 (DE3)/pETff-A2HCh生產的蛋白質分布；其中，徑1:蛋 白質標準物；徑2 :未經誘導的重組菌株生產的可溶性蛋白質；徑3 :經誘導的重組菌株生產的可溶性蛋白質；徑4 :未經誘導的重組菌株生產的不可溶性蛋白質；徑5 :經誘導的重組菌株生產的不可溶性蛋白質；箭頭AHL-HDT的融合蛋白質。圖7為非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯酰胺電泳膠圖，以說明重組菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDTh 及 BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac_HDTDoCh 生產的蛋白質分布；其中，徑1:蛋白質標準物；徑2 :經誘導的重組菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種融合蛋白質的制造方法，系包括：（a）構筑一編碼一錨定區域及一第一目標勝肽的第一核酸分子；（b）構筑一編碼一黏附區域及一第二目標勝肽的第二核酸分子；（c）遞送該第一核酸分子及該第二核酸分子至一宿主細胞內；以及（d）培養該宿主細胞，以表現一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且該第一融合勝肽具有該錨定區域及該第一目標勝肽，該第二融合勝肽具有該黏附區域及該第二目標勝肽，藉此該錨定區域連接于該黏附區域，以容許該第一融合勝肽及該第二融合勝肽相互融合。

【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白質的制造方法，系包括(a)構筑一編碼一錨定區域及一第一目標勝肽的第一核酸分子；(b)構筑一編碼一黏附區域及一第二目標勝肽的第二核酸分子；(c)遞送該第一核酸分子及該第二核酸分子至一宿主細胞內；以及(d)培養該宿主細胞，以表現一第一融合勝肽及一第二融合勝肽，且該第一融合勝肽具有該錨定區域及該第一目標勝肽，該第二融合勝肽具有該黏附區域及該第二目標勝肽，藉此該錨定區域連接于該黏附區域，以容許該第一融合勝肽及該第二融合勝肽相互融合。2.如權利要求1所述的制造方法，其中該錨定區域系衍生自由下列微生物組成的^ 且 \Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Butyrivibriofi bri sol vens、Cl os tri di um ace tobu tyli cum、Cl os tri di um cellobi oparum、Cl os tri di umcellulolyticum、Clostridium cellulovorans、Clostridium Josui Λ Clostridiumpapyrosol vens Λ Cl os tri di um thermocellum、Ruminococcus albus、Ruminococcusflavefaciens ^Neocallimas tix pa triciarum、Orpinomyces Joyoni1、Orpinomyces PC_2、Piomyces equi Λ Piomyces E2。3.如權利要求1所述的制造方法，其中該黏附區域系衍生自由下列微生物組成的^ 且 \Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Butyrivibriofi bri sol vens、Cl os tri di um ace tobu tyli cum、Cl os tri di um cellobi oparum、Cl os tri di umcellulo...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙云鵬，姜中人，林莉鈞，王祉雯，陳柏庭，
申請(專利權)人：逢甲大學，
類型：發明
國別省市：