自動化制備無細胞蛋白的設備及其制備蛋白質的方法技術

本發明專利技術涉及一種自動化制備無細胞蛋白的設備以及使用其制備蛋白質的方法，并且更具體地，涉及一種自動化制備無細胞蛋白的設備以及使用其制造蛋白質的方法，所述設備包括：包含反應容器的蛋白質表達反應單元，所述反應容器包括多個透析管，該透析管通過開口上部結構設有透析膜；用于加熱或者冷卻蛋白質表達反應單元的反應溫度控制單元；吸液管陣列，包括多個吸液管并能夠使用所述吸液管吸取或者排放溶液；吸液管陣列移動單元，能夠上下、前后或左右移動吸液管陣列從而移動溶液；設有磁場施加設備的蛋白質純化單元；以及多孔板安裝單元，能夠提供多孔板試劑盒，所述多孔板安裝單元供應用于蛋白質生產的溶液。此外，本發明專利技術涉及自動化制備無細胞蛋白的設備及其制備方法，其除親和標簽目標蛋白之外還能夠合成無親和標簽的純目標蛋白，并能夠通過多步透析自動且快速地用所需蛋白質儲存緩沖液替換含有最終純化蛋白的洗脫溶液，并且因此可以自動且方便地大量生產多種蛋白質。此外，本發明專利技術涉及用于自動化制備無細胞蛋白的反應試劑盒，包括用于存儲制備蛋白所需的溶液的多孔板試劑盒；以及設有透析膜的透析管。根據本發明專利技術的自動化制備無細胞蛋白的設備除了可以自動表達靶標蛋白并將其純化以外，還可以在蛋白質儲存緩沖液中進行透析，因此最終制備的蛋白能夠即刻得到使用。此外，本發明專利技術的制備蛋白的方法可以通過多級交換低分子量表達溶液而連續提供無細胞表達所需的能量源，使得相比于通過使用常規制備無細胞蛋白的方法獲得靶標蛋白，可以多獲得最大5倍的靶標蛋白，并且由于當使用磁鐵顆粒純化靶標蛋白，使用蛋白酶除去不必要的親和標簽制備純靶標蛋白，本發明專利技術在用于工業、醫學和研究目的的蛋白生產非常有用，其中可以制備去除了對蛋白活性和結構賦予副作用的人工序列的環形蛋白。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種自動化無細胞蛋白質生產系統以及一種使用該系統生產蛋白質 的方法。更具體地說，本專利技術涉及一種自動化無細胞蛋白質生產系統，包括：包含反應容器 的蛋白質表達反應單元，所述反應容器包括多個透析管，每個透析管包括透析膜并且頂部 開放；用于加熱或者冷卻反應容器的反應溫度控制單元；吸液管陣列，包括多個吸液管并 使用所述吸液管吸取或者排放溶液；吸液管陣列移動單元，在上下方向、前后方向或左右方 向移動吸液管陣列從而移動溶液；包括磁場施加裝置的蛋白質純化單元；以及多孔板安裝 單元，其中安裝有多孔板試劑盒，所述多孔板安裝單元供應用于蛋白質生產的溶液，并且本 專利技術涉及使用該系統生產蛋白質的方法。 另外，更具體地說，本專利技術涉及一自動化蛋白生產系統和方法，其除親和標簽目標 蛋白之外還能夠合成無親和標簽的純目標蛋白，并能夠通過多步透析自動且快速地用所需 蛋白質儲存緩沖液替換含有最終純化蛋白的洗脫溶液，并且因此可以自動且方便地大量生 產多種蛋白質。 此外，本專利技術涉及用于自動化無細胞蛋白質生產的反應試劑盒，其包含用于存儲 蛋白質生產所需溶液的多孔板試劑盒，以及含有透析膜的透析管。
技術介紹
通常使用不同細胞株，例如使用E. coli、酵母和動物細胞實施生產重組蛋白的方 法。這些方法包括將重組蛋白表達載體轉化至細胞株，培養細胞株以表達目標蛋白以及裂 解細胞以純化目標蛋白。 這些方法需要篩選用以穩定地表達重組蛋白質的菌株的過程，并且接下來要進行 包括細胞培養、細胞破碎和蛋白質純化的一系列過程。因此，這些方法需要大量的時間和精 力。 此外，細胞毒性蛋白質或膜蛋白質難以表達。因此，在這些蛋白質的情況下，需要 諸如嘗試不同的表達條件等很多努力。為此，存在著生產一種蛋白質就需要幾天到幾個月 的時間這一問題。 為了克服這個問題，已研發出無細胞蛋白質表達方法和與其相關的產品，所述方 法在不使用細胞的條件下，短時間內于反應容器如試管中表達蛋白。這些方法旨在不用細 胞培養來表達所需的蛋白質。這些方法使用包括目標基因的載體、細胞培養后通過分離/ 純化獲得的細胞提取物以及包括氨基酸、三磷酸核糖核酸、能量源和緩沖液的蛋白質表達 溶液。在這些方法中，利用細胞提取物中含有的RNA聚合酶將編碼所需蛋白質的基因轉錄 成mRNA，并利用細胞提取物中含有的核糖體、tRNA等將mRNA翻譯為蛋白質。 Roche、Promega等已經將無細胞蛋白質表達方法商業化。在這個方法中，將能表達 蛋白質的模板DNA (例如表達載體、PCR產物等），細胞裂解液以及包括氨基酸、三磷酸核糖 核酸、能量源的表達溶液加入試管，然后使其在合適溫度（30_40°C )下反應合適時間（1-3 小時）以表達目標蛋白。此方法優于使用細胞表達蛋白質的方法在于極大地減少了所需時 間，并能夠表達細胞毒性蛋白質或膜蛋白質。 此外，已研制出能通過自動化實施無細胞蛋白質表達方便地生產蛋白質的系統。 此系統包括由Roche研制的RTS (快速翻譯系統）。RTS能夠高效率地實施無細胞 蛋白質表達。在此系統中，為了防止在無細胞蛋白質表達過程中因為能量源耗盡和蛋白質 合成抑制劑（如磷酸）的積累導致反應停止，在反應容器底端配置透析膜。關于透析，為了 使反應最大化，將反應容器置于至少10倍體積的容器中，該容器包含小分子表達溶液。如 Kim, D. -M. and Choi, C. -Y.，Biotechnol. Prog.，12 (5) : 645, 1996 所述，這是基于通過透析 膜連續不斷地替換包括三磷酸核糖核酸、氨基酸、能量源的小分子表達溶液，能夠使蛋白質 表達水平提高達10倍的原理。 然而該方法存在一個問題，即還要使用體積相當于表達溶液體積的至少10倍的 小分子表達溶液，反應容器的總體尺寸變得更大，因此當同時平行合成不同種類的蛋白質 時，系統的尺寸顯著增大。另外，這個系統不是自動化的，在某一溫度下只能實施攪拌反應 溶液的功能。因此，要實施諸如反應后合成蛋白質的純化的單獨步驟。 RIKEN研宄所（日本）通過構建這個大型系統實現了蛋白質的自動化表達，但是 沒有說明該系統的具體結構（Alexander Spirin&James R. Swartz, Cell-Free Protein Synthesis, 103頁，圖6. 3B)。Yaeta Endo等人開發了一種利用小麥胚芽提取物的無細胞表 達蛋白質的方法，和一種基于不同于RTS系統的原理的自動化系統。并且，Yaeta Endo等 人通過用小分子表達溶液稀釋無細胞蛋白質表達溶液并濃縮稀釋液能夠提高蛋白質表達 產量（US 2006/0257997 A1)。 然而，上述自動化系統由于結構復雜而存在價格昂貴的問題，而且沒有蛋白質純 化功能，如RTS系統，生產幾種蛋白質是很困難的。 同時，含有通過細胞培養或者無細胞蛋白質表達方法表達的重組蛋白質的樣品中 含有除目標蛋白以外的不同種類的蛋白質。為了容易地從這個樣品中純化目標蛋白，應用 連接親和標簽（組氨酸標簽）的技術。在這個技術中，當組氨酸標簽的編碼序列被導入模 板基因中時，組氨酸標簽連接到由模板基因產生的蛋白質的C端或N端，通過利用組氨酸標 簽和金屬離子（鎳離子、鈷離子等）之間的親和力分離/純化目標蛋白質，能夠容易地獲得 尚純度的目標蛋白。 然而用于純化的親和標簽會對目標蛋白的活性和結構造成不利影響。為此，為了 生產用于蛋白質功能研宄和醫學目的的目標蛋白，需要去除標簽的過程。 本專利技術人（Bioneer)研制出自動化蛋白質合成系統ExiProgen?(韓國專利公開號 10-2011-0121588和10-2013-0023091)和相關的試劑盒。這個系統自動化地實施無細胞蛋 白質表達反應并純化表達的蛋白質。在這個系統中，反應所需的模板DNA和溶液能夠自動 化地混合以便自動化地實施蛋白質表達反應，并能夠保持在合適的反應溫度。并且，包括從 DNA合成RNA以及從RNA表達蛋白質在內的所有過程都能夠保持在最佳溫度。而且，為了容 易地從包括表達的蛋白質的混合樣品中純化目標蛋白，將親和標簽如寡聚組氨酸連接到目 標蛋白，目標蛋白以這樣的狀態表達，并利用連接有二價金屬離子（鎳離子、鈷離子等）的 磁珠自動地純化。上述ExiProgen?和試劑盒能夠同時表達并純化不同種類的蛋白質，但是 存在這樣的問題，即因為蛋白質的表達是以批處理方式實施，隨著時間的推移能量源耗盡， 蛋白質的表達被積累的蛋白質表達抑制劑終止，因此最終表達的蛋白質的水平低。 為了提高蛋白質表達水平，應連續不斷地供應含有三磷酸核糖核酸、氨基酸、能量 源的小分子表達溶液，并去除蛋白質表達抑制劑。為了自動化地實施這些操作，需要新型反 應器和系統。 本專利技術人已經努力研制出一種系統和試劑盒，其能夠克服自動化蛋白質合成器 ExiProgen?的蛋白質表達效率低的缺點，并且在消除因使用具有表達溶液體積10倍或者 更多量的小分子表達溶液引起的系統尺寸增加的需要同時，提高了目標蛋白的表達水平。 因此，本專利技術人已經研制了一種能提高目標蛋白表達水平的系統，其通過在無細胞蛋白質 表達反應過程中，經透析膜連續不斷地供應小分子表達溶液，并去除蛋白質表達抑制劑來本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種自動化無細胞蛋白質生產系統，包括：包括反應容器的蛋白質表達反應單元，所述反應容器包含一個或多個透析管，每個透析管包含透析膜并且頂端開放；反應溫度控制單元，配置為加熱或冷卻反應容器；吸液管陣列，包括一個或多個吸液管并且配置為利用所述吸液管吸取或排放溶液；吸液管陣列移動單元，配置為在上下方向、前后方向或左右方向移動吸液管陣列以移動溶液；蛋白質純化單元，包括磁場施加裝置；和多孔板安裝單元，其中安裝有多孔板試劑盒，所述多孔板試劑盒配置為提供用于蛋白質生產的溶液。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：樸翰語，金鐘甲，韓指元，趙俞相，金敏貞，金荷娜，李洋源，金楠鎰，
申請(專利權)人：株式會社百奧尼，
類型：發明
國別省市：韓國;KR