包含cFms胞外片段的融合蛋白質及其制備方法和應用技術

本發明專利技術提供了一種包含巨噬細胞刺激因子受體(cFms)胞外片段的融合蛋白質，它由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fc通過一連接肽相連構成，命名為cFmsECD-Fc；cFms受體的細胞外片段由5個免疫球蛋白(IgG)樣胞外結構域中的至少兩個構成。構成的融合蛋白質包括YY-001、YY-002、YY-003、YY-004、YY-005、YY-006和YY-007。本發明專利技術提供的融合蛋白質，具有結合白細胞介素-34(IL-34)和結合巨噬細胞刺激因子(M-CSF)，阻斷IL-34/M-CSF配體跟共用受體cFms的結合的作用，適合治療異常情況下由IL-34/M-CSF所引起的疾病。對自身免疫性疾病、炎癥性疾病、骨質疏松癥和腫瘤具有潛在的治療前景。用于制備抑制炎癥性疾病的藥物、抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥物或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫藥工程技術，尤其涉及一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質及其制備方法和應用。
技術介紹
白細胞介素-34(IL_34)和巨噬細胞刺激因子(M-CSF)屬于細胞生長因子。雖然在DNA序列上沒有相似性，它們卻共用受體cFms。雖然彼此間有許多生物學功能相似，但與受體結合后所利用的細胞內信號傳遞通路不完全相同，并且彼此在組織中表達也有差異。白細胞介素-34和巨噬細胞刺激因子參與單核細胞/巨噬細胞系細胞的生存、增殖、分化和激活。在免疫反應和炎癥中，白細胞介素-34和巨噬細胞刺激因子與其受體(cFms)結合激活單核細胞/巨噬細胞，促進細胞毒性功能，細胞吞噬功能，化學趨向性和細胞因子的產生，調節樹突狀細胞的功能。IL-34/M-CSF/cFms也在骨骼代謝方面發揮重要作用。IL-34/M-CSF與核因子kappa-B受體配體活化子(RANKL) —道參與人破骨細胞前體的增殖、分化和融合，并參與后期骨質的吸收。致炎因子白細胞介素-1 (IL-1)和腫瘤壞死因子a (TNFa)能刺激人成纖維細胞、軟骨細胞、類風濕性關節炎(RA)關節滑膜血管內皮細胞生成IL-34和M-CSF。在自身免疫性疾病患者的血漿和關節滑膜液中，IL-34和M-CSF水平明顯增高。M-CSF敲除的小鼠(Csflop/op)不能誘發關節炎。在小鼠關節炎模型，應用抗M-CSF抗體或M-CSF抑制劑能減少小鼠關節中巨噬細胞數目及降低IL-1和TNFa水平，抑制破骨細胞形成和激活，減輕骨骼和軟骨的破壞，減弱疾病活動性，降低疾病的整體臨床評分。 在骨巨細胞瘤，IL-34表達水平增高，參與RANKL誘導的破骨細胞溶骨作用。給小鼠腹腔內注射外源性IL-34，增加單核細胞/巨噬細胞系分化和增殖，并且誘導破骨細胞分化和骨質吸收，引起骨質疏松。用基因工程方法在M-CSF缺失小鼠(Csflop/op)體內表達IL-34，可以恢復動物由于M-CSF缺失所致的骨質、破骨細胞、組織巨噬細胞、生育等方面缺陷。在RA病人，TNF a促使成纖維樣滑膜細胞產生IL-34，參與破骨細胞的形成和激活。除了在自身免疫性炎性疾病中扮演重要角色外，IL-34/M-CSF也在腫瘤生長、發育和轉移中起重要作用。M-CSF水平與許多惡性腫瘤的預后相關。在許多惡性腫瘤，血中M-CSF水平增高，腫瘤的預后則差。在腫瘤異種移植模型動物上，抑制cFms則能抑制腫瘤轉移導致的溶骨性骨質破壞。用細胞毒性療法(如化學療法)治療乳腺癌時，乳腺上皮細胞增加分泌IL-34和M-CSF，通過與受體cFms結合，促進巨噬細胞浸潤。在小鼠乳癌模型，聯合細胞毒性療法和cFms受體阻段劑或酪氨酸激酶抑制劑，減少腫瘤相關巨噬細胞(TAM)數量，延長動物的生存率，減慢原發腫瘤的發展和降低肺臟轉移。在原發癌組織中，腫瘤相關巨噬細胞數量減少可增加細胞毒性T細胞的數量。而細胞毒性T細胞能增強癌細胞對化療的敏感性，加強癌癥治療效果。cFms受體含有554個氨基酸，分為三個主要區域(參見圖1) :5個IgG樣胞外結構域(分別記作Dl、D2、D3、D4、D5)、一個跨膜區域和一個絡氨酸激酶的胞內結構域(UniProtKB/Swiss-Prot entry P07333)。在5個IgG樣胞外結構域中，結構域D2和結構域D3與IL-34/M-CSF的結合和功能是必需的，結構域Dl與IL-34和M-CSF的穩定結合是必要的。在一定程度上，結構域D4和結構域D5能提高IL-34與cFms的結合及隨后引起的細胞內信號傳遞。
技術實現思路
本專利技術的目的，就是為了提供一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質。為了達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fe通過一連接肽相連構成,命名為cFmsE⑶-Fe ;所述cFms受體的細胞外片段由5個IgG樣胞外結構域中的至少兩個構成,5個IgG樣胞外結構域分別記作Dl、D2、D3、D4和D5 ;所述免疫球蛋白Fe來自于IgGl，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述連接肽的編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-001，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 19所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-002，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 20所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。 上述一種包含cFm s胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQID NO. 14所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-003，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 28所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-004，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 22所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-005，其編碼核苷酸序列如SEQ IDNO. 23所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 30所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-006，其編碼核苷酸序列如SEQID NO. 24所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 31所示。上述一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其中，所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D3-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-007，其編碼核苷酸序列如S本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于：由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fc通過一連接肽相連構成，命名為cFmsECD?Fc；所述cFms受體的細胞外片段由5個IgG樣胞外結構域中的至少兩個構成，5個IgG樣胞外結構域分別記作D1、D2、D3、D4和D5；所述免疫球蛋白Fc來自于IgG1，其編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述連接肽的編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

【技術特征摘要】
1.一種包含cFms胞外片段的融合蛋白質,其特征在于由cFms受體的細胞外片段與人免疫球蛋白Fe通過一連接肽相連構成，命名為cFmsE⑶-Fe ;所述cFms受體的細胞外片段由5個IgG樣胞外結構域中的至少兩個構成，5個IgG樣胞外結構域分別記作D1、D2、D3、D4和D5;所述免疫球蛋白Fe來自于IgGl，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述連接肽的編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-001，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示。3.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-002，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 27所示。4.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-003，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 28所示。5.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D3-D4-D5，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-004，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。6.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片段為D1-D2-D3-D4，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所構成的融合蛋白質命名為YY-005，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 23所示，其核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 30所示。7.根據權利要求1所述的包含cFms胞外片段的融合蛋白質，其特征在于所述的cFms受體的細胞外片...

【專利技術屬性】
技術研發人員：殷勇，鄭學初，
申請(專利權)人：雷克塞德蘇州生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：