一種抗腫瘤融合蛋白及其制備方法和用途技術

本發明專利技術公開了一種抗腫瘤融合蛋白及其制備方法和用途，其氨基酸序列為SEQ.ID.NO:1所示。所述EFB的制備方法還是首先獲得編碼有上述融合蛋白的DNA。本發明專利技術所述藥品制劑可用于治療腎癌，胰腺癌，非小細胞肺癌，前列腺癌，卵巢癌，神經膠質瘤，頭頸癌，乳腺癌、肺癌、胃癌、膀朧癌、前列腺癌、直腸結腸癌、子宮頸癌、和腦瘤等各種腫瘤。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及DNA重組技術和醫藥制藥領域，具體地說是涉及與人表皮生長因子受體密切關聯的一種抑腫瘤融合蛋白及其制備方法和用途。
技術介紹
惡性腫瘤是威脅人類健康與生命的重大疾病之一，其發病率和死亡率逐年升高，而目前臨床仍然缺乏非常有效的藥物。近年來研究發現腫瘤的發生往往是由腫瘤細胞對凋亡抵抗所致，同時細胞凋亡機制發生異常。因此如何調控細胞凋亡成為了當今抗腫瘤藥物研究中的重要課題。在細胞凋亡研究中人們發現，Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡通路的關鍵蛋白分子。Bcl-2家族至少包含17個以上成員。按照其結構與功能上的不同，Bcl-2家 族可以分為 3 組①抗凋亡(antiapoptotic orprosurvival)家族，包括 Bcl_2、Be1-XL >Mcl-U Bcl-w和Al，它們均含有4個BH結構域(BH1-4);②含有多個BH結構域促凋亡(pro-apoptotic)家族,包括Bax和Bak ;③唯BH3域結構促凋亡家族,它們僅含有與Bcl_2同源的 BH3 結構域，包括 Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk, Noxa、PUMA 和 Beclin-10 唯 BH3 結構域蛋白是凋亡作用的效應分子，其惟一的已知結構域BH3是其促凋亡功能的關鍵效應結構?？沟蛲鯞cl-2家族蛋白和促凋亡Bcl-2蛋白家族成員之間發生失衡是引發腫瘤發生的重要原因和標志性事件。當Bcl-2抗凋亡家族蛋白在細胞中有過度表達時，使得細胞的凋亡過程受阻，從而導致腫瘤發生。隨著細胞凋亡研究的深入，人們發現Bcl-2家族蛋白的BH3結構域在線粒體介導的細胞凋亡過程中亦發揮著重要的作用。Bcl-2家族促凋亡蛋白在細胞凋亡信號刺激下活化，其通過BH3結構域結合Bcl-2抗凋亡蛋白，由此形成二聚體，從而拮抗了抗凋亡蛋白的活性，由此促使腫瘤細胞凋亡。基于這些研究成果，許多小分子BH3模擬物如SAHB-BID，Cpm-1285, ABT-737, Obatoclax等多種腫瘤抑制劑已經進入臨床前和臨床試驗階段。實驗表明，這類抑制劑可與某些抗凋亡蛋白相互作用，拮該抗凋亡蛋白功能。但是這類藥物開發中也發現，僅抑制腫瘤細胞中一種或幾種Bcl-2抗凋亡蛋白，其抗腫瘤效果并不十分理想。如ABT-737只能有效的結合Bcl-xL，Bcl-2和Bcl_w，并不能結合Mcl-1，這樣就會導致腫瘤細胞對ABT-737產生抗性；反義核酸Genasense在聯合化療治療多腫瘤時療效欠佳。另外，也有研究表明，即使設計的分子BH3結構域模擬物如TW37可以所有類型的Bcl-2抗凋亡家族發生反應，其單獨應用的療效仍不盡如人意，因此，在應用時仍需與其他抑制劑協同用藥。目前，小分子BH-3模擬物類抑制劑還存在的問題有(I)小分子BH-3模擬靶向特異性差，其不只會進入腫瘤細胞，同樣也會進入到正常細胞內。(2)現有的BH3肽段細胞透過性以及生物利用度均較低，結構的可溶性和代謝的穩定性也有待進一步完善。在腫瘤細胞學研究中人們還發現表皮生長因子受體(EGFR)在許多腫瘤細胞(胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌)中都有過度表達。表皮生長因子受體EGFR正常情況下主要表達在表皮細胞和間充質細胞系，其配體包括EGF、TGFa、HB-EGF等。EGFR本身具有酪氨酶激酶活性，一旦與表皮生長因子(EGF)組合可啟動細胞核內的有關基因，從而促進細胞分裂增殖。當EGFR過度表達時，常常會導致腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及抗凋亡。EGFR 過度表達常常預示著無病生存期和總生存期下降、復發及遠處轉移的風險增加。因此，針對 EGFR靶向治療，阻斷EGFR信號傳導通路，亦是抗腫瘤藥物研究的重要方向之一。目前，有研究人員將抗EGFR抗體或EGF與強效的細胞毒素如白喉毒素、蓖麻毒素和天花粉蛋白藕聯后與EGFR結合，由此誘導細胞凋亡。也有研究人員通過細胞殺傷因子、放射性粒子等來選擇性殺死富含EGFR腫瘤細胞。但這些方法的靶向特異性尚待進一步改善。本專利技術的目的有以下幾個方面第一是提供一種具有雙靶向、特異性好、并可有效抑制腫瘤細胞的抗腫瘤融合蛋白；第二是提供一種編碼有所述抗癌融合蛋白的DNA ；第三是提供一種含有所述抗癌融合蛋白DNA的載體；第四是提供所述抗腫瘤融合蛋白在制備抑制腫瘤藥物中的應用；第五是提供一種含有所述抗腫瘤融合蛋白的藥物組合物。 第六是提供一種制備所述抗腫瘤融合蛋白的方法。本專利技術的第一方面通過以下方式實現的本專利技術所提供的抗腫瘤融合蛋白的名稱為抗腫瘤融合蛋白EFB (簡稱EFB)，其氨基酸序列為SEQ.1D. NO:1所示。其包括有a、EGF氨基酸序列；b、BID含BH3結構域的蛋白的部分或者全長氨基酸序列；c、EGF氨基酸序列與含BH3結構域的蛋白的部分或者全長氨基酸序列選用Furin 敏感位點連接。本專利技術可在不改變EGF進入細胞功能的情況下，添加不同的氨基酸序列使得它有不同的細胞定位如定位到內質網，線粒體，溶酶體囊泡等。本專利技術所述含BH3結構域的蛋白為Bcl-2促凋亡家族中的Bid。本專利技術是將EGF基因與含BH3結構域的蛋白基因通過連接肽(綠膿桿菌外毒素 A(TRHRQPRGWE, Fpe))進行融合的。由此構成兼具EGF、BH3結構域兩者生物功能的融合蛋白。其中EGF與BH3結構域也可以直接連接。本專利技術所述EFB可通過基因重組技術獲得，即首先獲得編碼有上述融合蛋白的 DNA。DNA的獲得可以通過常規技術，如PCR合成，化學合成等方法，使用酶切的技術被克隆到載體中。所用載體可以是分子生物學所常用的質粒、病毒或DNA片斷。載體序列中包含適合重組蛋白表達的所有原件如驅動基因表達的增強子和啟動子，蛋白質翻譯起始和終止信號，以及多聚腺苷酸序列等表達原件。載體中有抗菌素抗性基因以利于質粒在細菌中所繁殖。另外，載體中還包括真核細胞選擇性基因用于穩定轉染細胞株的選擇。在完成上列各種融合蛋白的質粒構建以后，即可用質粒DNA轉染細胞，表達相應的蛋白質。能夠用于表達這些融合蛋白的表達系統有多種，它們包括(但不限于)哺乳動物細胞，細菌，酵母，昆蟲細胞，等等。編碼重組蛋白的質?？山涋D染((transfection)進入細胞。轉染細胞的方法有多種，其中包括(但不限于)電轉(electroporation),脂質體 (liposome)介導，|丐介導，等等。本專利技術所述EFB進行拼接時，連接肽的設計可按照本領域中的常規方法進行設計(如參見 Hudson PJ, Recombinant antibody fragments. CurrentOpinion in Biotechnology,1998, 3:279-299.Gary Thomas.Furin at the cuttingedge: From protein traffic to embryogenesis anddisease. Nat Rev Mol CellBiol. 2002, 3(10) :753 - 766)。本專利技術第二方面通過以下方式實現編碼有本專利技術所述抗癌融合蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ.1D. NO:2所示。 該編碼DNA可以化學合成，也可以通過常規技術的PCR擴增、酶切被克隆到載體中。本專利技術第三方面通過以下本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗腫瘤融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.ID.NO:1所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳川，楊潤蕾，羅都強，
申請(專利權)人：河北大學，
類型：發明
國別省市：