本發明專利技術的目的是提供一種IBD病毒VP2蛋白和IL-2的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。本發明專利技術是將雞IBDV超強毒的VP2蛋白與具有免疫增強作用的雞IL-2蛋白融合表達，制備的疫苗經皮下注射后對雞抵抗雞傳染性法氏囊病強毒攻擊具有堅強的抵抗力。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程亞單位疫苗
，具體涉及IBD病毒VP2蛋白和雞IL-2的融合蛋白及其應用，即雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和雞IL-2的融合蛋白及應用。
技術介紹
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)主要侵害雞的中樞免疫器官法氏囊，從而導致免疫抑制，增加了機體對其它病原體的易感性，降低對其它疫苗的反應性，國外學者形象地稱該病為雞的“艾滋病”。雖然各國學者在IBD疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能從根本上扭轉IBD流行日趨嚴重的現狀。近十幾年來，由于雞傳染性法氏囊病病毒IBDV超強毒株和變異株的出現、抗原變異和血清亞型的多樣性，使目前的商品化疫苗不能提供足夠的保護，其保護率僅達109Γ70%。超強毒株的毒力是標準病毒株的兩倍以上，使雞的發病率和死亡率明顯上升，年齡較大的雞甚至18周齡以上的后備母雞也能致 病。傳統的滅活疫苗和弱毒疫苗已經面臨著嚴峻的考驗。因此，需要篩選出新的超強毒株的變異基因來制備新的疫苗。雞白介素-2 (Interleukin-2，IL-2)是重要的免疫調控因子，能以非特異性的方式增強針對特異性抗原的免疫力。眾多試驗結果與臨床應用表明IL-2作為疫苗佐劑在治療多種感染性疾病時具有良好的佐劑效應。IL-2的免疫增強劑不同于以往的化學佐劑，它們能調節動物對疫苗的反應，包括免疫細胞向接種部位移動，抗原提呈，促進Th細胞的產生，B細胞的成熟和分化，激活包括NK細胞、嗜酸性細胞和肥大細胞在內的非特異性殺傷細胞。而將IBD的VP2蛋白與IL-2蛋白融合表達，能增強IBD的VP2免疫力，刺激細胞免疫，從而提高IBD VP2亞單位疫苗的使用效果。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種IBD病毒VP2蛋白和IL-2的融合蛋白及其應用，涉及一種IBDV VP2蛋白與雞IL-2融合蛋白的制備及應用，即將臨床分離的IBDV超強毒株的VP2蛋白與免疫增強作用的IL-2蛋白通過一個柔性linker連接起來，獲得了一個融合蛋白，該蛋白經過純化后制成疫苗可以是免疫雞抵抗IBDV強毒及超強毒的攻擊而不引起免疫抑制。本專利技術的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。用于編碼上述融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本專利技術的融合蛋白用于制備亞單位疫苗。上述的亞單位疫苗的制備方法如下取注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相罐中混合均勻，加熱融化至半透明狀，再加6份的司本-80高壓滅菌作為油相備用；取滅菌的4份吐溫-80，加入96份的融合蛋白，充分攪拌至吐溫-80完全溶解作為水相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即可制備雞傳染性法氏囊病病毒VP2亞單位疫苗。上述制備的亞單位疫苗用來防治雞傳染性法氏囊病。本專利技術是將雞IBDV超強毒的VP2蛋白與具有免疫增強作用的雞IL_2蛋白融合表達，制備的疫苗經皮下注射后對雞抵抗雞傳染性法氏囊病強毒攻擊具有堅強的抵抗力。具體實施例方式IBDV的主要結構蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護性抗原，而雞IL_2具有明顯的免疫增強作用，本專利技術是用重疊延伸PCR方法將兩種基因通過linker連接起來，克隆到pET-28a載體上，轉化BL21(DE3)，經IPTG誘導后VP2-1L2融合蛋白獲得了表達，將表達菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2-1L2蛋白溶液，加入礦物油佐劑制成油乳劑疫苗，可用于預防雞傳染性法氏囊病，效果優于VP2亞單位疫苗。下面結合具體的實施例對本專利技術的融合蛋白進行詳細的描述。·一、VP2基因的篩選用Primer5. O軟件設計了一對擴增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護性堿基及BamH I酶切位點，在下游引物的5'端加入保護性堿基和Xho I酶切位點，引物序列為Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 μ 用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按RNAisoReagent說明書所述方法提取病毒RNA,按反轉錄試劑盒使用說明書進行反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，擴增體系為(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ ,上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgC12 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΜΗ2034μ1 ;PCR 反應參數95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個循環，72 °CIOmin。得到一個1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6μ1，Τ 載體 2μ1 (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，總計25μ1。16°C過夜連接，取20 μ 連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，挑選10個白色菌落培養，提取質粒鑒定正確的選取3個測序，結果3個質粒的測序結果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴增的過程中沒有產生錯誤，其核苷酸序列為SEQ ID Ν0:4，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO:3。將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對，有十幾個堿基發生了點突變，表明該毒株為一株新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護性抗原，經常發生突變而導致抗原性發生差異。二、VP2重組蛋白的表達將鑒定正確的上述一個質粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個酶切的pET-28a載體連接，轉化感受態大腸桿菌JM109，提取質粒鑒定正確后轉化感受體的BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉接5mlLB小管培養基，37°C振蕩培養3 4小時至0D600為O. 6時，加入終濃度為O. 8mM的IPTG誘導4飛小時，SDS-PAGE電泳結果證實為分泌表達。將表達菌用10倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴散試驗，結果瓊擴效價不低于1:64。三、VP2蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亞單位疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，混合后，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白發酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01 %。VP2亞單位疫苗的免疫效果將20只SPF雞隨機分為兩組，每組10只，其中一組在21日齡時以O. 3ml/只的劑量皮下注射VP2亞單位疫苗，免疫21日后連同不免疫對照組每只經點眼途徑接種100BID雞傳染性法氏囊病強毒BC6-85株毒液，攻毒后每天觀察雞只的臨床表現及死亡情況，記錄 發病和死亡雞數，剖檢觀察死亡雞法氏本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和雞白介素?2的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王雷，凌紅麗，王宏華，王睿智，
申請(專利權)人：青島康地恩藥業股份有限公司，青島寶依特生物制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。