本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。本發(fā)明專利技術(shù)是將雞IBDV超強(qiáng)毒的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑大腸桿菌LTB蛋白融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物乳化制備疫苗，免疫21日齡SPF雞，并設(shè)VP2亞單位疫苗免疫對(duì)照及不免疫對(duì)照，免疫后7日測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，免疫?21日采血測(cè)定血清瓊脂免疫擴(kuò)散抗體效價(jià)并連同不免疫對(duì)照攻毒，結(jié)果各疫苗免疫組均能抵抗強(qiáng)毒攻擊，而淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清抗體效價(jià)均明顯高于VP2免疫對(duì)照組，具有良好的免疫原性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程亞單位疫苗
，具體涉及IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其應(yīng)用，即雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)主要侵害雞的中樞免疫器官法氏囊，從而導(dǎo)致免疫抑制，增加了機(jī)體對(duì)其它病原體的易感性，降低對(duì)其它疫苗的反應(yīng)性，國(guó)外學(xué)者形象地稱該病為雞的“艾滋病”。雖然各國(guó)學(xué)者在IBD疫苗的研究上取得了巨大成就，但均未能從根本上扭轉(zhuǎn)IBD流行日趨嚴(yán)重的現(xiàn)狀。近十幾年來(lái)，由于雞傳染性法氏囊病病毒IBDV超強(qiáng)毒株和變異株的出現(xiàn)、抗原變異和血清亞型的多樣性，使目前的商品化疫苗不能提供足夠的保護(hù)，其保護(hù)率僅達(dá)109^70%。超強(qiáng)毒株的毒力是標(biāo)準(zhǔn)病毒株的兩倍以上，使雞的發(fā)病率和死亡率明顯上升，年齡較大的雞甚至18周齡以上的后備母雞也能致病。傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗已經(jīng)面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-liable enterotoxin, LT)是由腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotox1-genetic E. coli,ETEC)分泌的一種外毒素,具有很強(qiáng)的免疫佐劑特性。大腸埃希菌不耐熱腸毒素是六聚體蛋白，由I個(gè)分子質(zhì)量為28 ku的A亞基和5個(gè)分子質(zhì)量為11 ku的B亞基單體組成，形成AB5型結(jié)構(gòu)。A亞基具有毒性作用，而B(niǎo)亞基具有較強(qiáng)的免疫佐劑作用，并可避免A亞基的毒性作用，無(wú)毒且具有佐劑活性的B亞單位被研究者所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)IBD通常通過(guò)經(jīng)消化道和呼吸道等粘膜途徑感染，良好的局部粘膜免疫是抵抗該病感染的重要防線，所以通過(guò)模擬病原體的自然感染途徑，增強(qiáng)病原體最初侵入的呼吸道和消化道粘膜局部產(chǎn)生特異性的抗體，進(jìn)而引起全身性系統(tǒng)免疫應(yīng)答，對(duì)防治該病具有重要意義。因此，建立一種能夠預(yù)防雞傳染性法氏囊病的基因工程亞單位疫苗就具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種IBD病毒VP2蛋白和LTB的融合蛋白及其應(yīng)用，涉及一種IBDV VP2蛋白與大腸桿菌LTB融合蛋白的制備及應(yīng)用，即將臨床分離的IBDV超強(qiáng)毒株的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑作用的大腸桿菌LTB蛋白通過(guò)I inker連接起來(lái)，獲得了一個(gè)融合蛋白，該蛋白經(jīng)過(guò)純化后制成疫苗可以是免疫雞抵抗IBDV強(qiáng)毒及超強(qiáng)毒的攻擊而不引起免疫抑制。本專利技術(shù)的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。用于編碼上述融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本專利技術(shù)的融合蛋白用于制備亞單位疫苗。一種亞單位疫苗的制備方法如下取注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相罐中混合均勻，加熱融化至半透明狀，再加6份的司本-80高壓滅菌作為油相備用；取滅菌的4份吐溫-80，加入96份的融合蛋白，充分?jǐn)嚢柚镣聹?80完全溶解作為水相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即可制備雞傳染性法氏囊病病毒VP2亞單位疫苗。上述制備的亞單位疫苗用來(lái)防治雞傳染性法氏囊病。本專利技術(shù)是將雞IBDV超強(qiáng)毒的VP2蛋白與具有粘膜免疫佐劑大腸桿菌LTB蛋白融合表達(dá)，制備的疫苗經(jīng)皮下注射后對(duì)雞抵抗雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒攻擊具有堅(jiān)強(qiáng)的抵抗力。具體實(shí)施例方式IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護(hù)性抗原，而大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB是良好的粘膜免疫佐劑，本專利技術(shù)是用重疊延伸PCR方法將兩種基因通過(guò)linker連接起來(lái)，克隆到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后VP2-LTB融合蛋白獲得了表達(dá)，將表達(dá)菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2-LTB蛋白溶液，加入礦物油佐劑制成 油乳劑疫苗，可用于預(yù)防雞傳染性法氏囊病，效果優(yōu)于VP2亞單位疫苗。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)的融合蛋白進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、VP2基因的篩選用Primer5. 0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護(hù)性堿基及BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物的5'端加入保護(hù)性堿基和Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列為Primer1:5' -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 :5' -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 W用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按RNAisoReagent說(shuō)明書(shū)所述方法提取病毒RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為(50 m) 10XPCR Buffer 5W，dNTP (lOmM each) ml,上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，Taq酶(5U/>1 ) ll^l，ddH2034W ;PCR 反應(yīng)參數(shù)95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)，72 °CIOmin。得到一個(gè)1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6W，T 載體 2W (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 1W，T4 buffer 2. 5W，水13. 5W，總計(jì)25沿。16°C過(guò)夜連接，取20沿連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑選10個(gè)白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒鑒定正確的選取3個(gè)測(cè)序，結(jié)果3個(gè)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴(kuò)增的過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生錯(cuò)誤，其核苷酸序列為SEQ ID N0:4，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO:3。將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對(duì)，有十幾個(gè)堿基發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致翻譯的氨基酸序列也有幾個(gè)位點(diǎn)專利技術(shù)變化。表明該毒株為一新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護(hù)性抗原，經(jīng)常發(fā)生突變而導(dǎo)致抗原性發(fā)生差異。二、VP2重組蛋白的表達(dá)將鑒定正確的上述一個(gè)質(zhì)粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個(gè)酶切的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受體的BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接5mlLB小管培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)3 4小時(shí)至0D600為0. 6時(shí)，加入終濃度為0. 8mM的IPTG誘導(dǎo)4飛小時(shí)，SDS-PAGE電泳結(jié)果證實(shí)為分泌表達(dá)。將表達(dá)菌用10倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細(xì)菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1:64。三、VP2蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過(guò)夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亞單位疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，混合后，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘做為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白發(fā)酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，做為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨 內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 01 %。VP2亞單位疫苗的免疫效果將20只SPF雞隨機(jī)分為兩組，每組10只，其中一組在21本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和大腸桿菌腸毒素LTB的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王雷，凌紅麗，王宏華，王睿智，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島康地恩藥業(yè)股份有限公司，青島寶依特生物制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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