一種朊蛋白抗體及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種朊蛋白抗體及其制備方法和應用。具體地，所述的抗體具有以下特征：(a)由不表達朊蛋白的動物所產生的，并且特異性針對該種動物的朊蛋白；(b)所述抗體與所述動物的朊蛋白的結合效價大于10000；其中，所述動物為家畜。本發明專利技術還提供了制備所述抗體的方法及其應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體地，涉及一種朊蛋白抗體及其制備方法和應用。
技術介紹
朊病毒相關疾病(又稱Prion疾病)是一組表現為散發性、家族性及傳播性的中樞神經系統的慢性退行性疾病，為人獸共患的新型傳染病。該疾病的主要特點是中樞神經細胞大量死亡、大腦空泡化以及伴隨的星型膠質細胞增生等，這些病變導致運動障礙、癡呆，最終導致患病動物死亡。目前，動物的Prion疾病有多種，除羊癢病(Scrapie)外，還包括傳染性水貂腦病(TME)，鹿慢性消耗性疾病(CWD)，牛海綿狀腦病(BSE)及貓海綿狀腦病(FSE);人的Prion疾病有克雅氏病(CJD)，庫魯病(KURU)和格斯特曼綜合征(GSS)和家族致死性失眠癥(FFI)等。綿羊和山羊的癢病是Prion病的原型，瘋牛病就是通過污染了癢病病原的反芻動物肉骨粉而傳播的。近年來越來越多的證據支持瘋牛病是人類新變異型克雅氏病(rwCJD)的病因，引起了全世界對瘋牛病的恐慌，各國政府均對該病給予高度重視，我國也已將其列為法定報告動物疾病。朊病毒疾病等對人類社會的衛生、經濟和食品安全都存在著嚴重的威脅。異常折疊的PrPse具有部分抵抗蛋白酶K消化的能力，經蛋白酶K消化后，N端被降解而C端保留，從而形成一個分子量大于為27-30kDa的片段，而正常折疊的朊蛋白經蛋白酶K消化后則被完全降解。經典的朊病毒檢測方法正是基于朊蛋白以上的生物化學性質，將待測樣品經蛋白酶K消化后進行western blot檢測，如果有27_30kDa的條帶則判斷為陽性，否則為陰性。該方法已經成為確診一個動物個體是否有朊病毒感染的金標準。目前存在若干Prion疾病的防治手段，如敲除家畜的Prion基因，制備不產生朊蛋白的家畜，但是該方法費用昂貴，轉基因克隆動物存活率低，不易推廣。就Prion疾病得診斷方法而言，國際上普遍采用特異性抗PrP抗體介導的免疫學檢測方法。朊蛋白類疾病的檢測市場異常巨大，種類繁多(各種動物肉制品、動物肉骨粉飼料、動物以及人血液制品、甚至包括有些化妝品等)，每年光涉及瘋牛病牛群的檢測、進出口牛肉的檢測樣品至少有幾百萬甚至幾千萬份，現有技術獲得的朊蛋白抗體無法滿足大量的檢測市場的需要。因此，本領域迫切需要建立快速、準確的診斷方法，且批量生產各類抗朊蛋白抗體，為Prion疾病的診斷與防治、切斷感染源,減少Prion疾病的傳播提供保證。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種朊蛋白抗體。本專利技術的另一目的是提供一種制備所述抗體的方法。本專利技術的另一目的是提供所述抗體方法的應用。 在本專利技術的第一方面，提供了一種分離的、特異性與朊蛋白結合的抗體，所述的抗體具有以下特征(a)由不表達朊蛋白的動物所產生的，并且特異性針對該種動物的朊蛋白；(b)所述抗體與所述動物的朊蛋白的結合效價大于10000 ；其中，所述動物為家畜。在另一優選例中，所述的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗血清。在另一優選例中，所述的抗體的類型為IgG。在另一優選例中，所述抗體由不表達朊蛋白的羊產生且特異性針對羊的朊蛋白。在另一優選例中，所述抗體的效價大于12000。在另一優選例中，所述抗體的效價大于15000，較佳地，所述抗體的效價為16000-25000。在另一優選例中，所述抗體是通過包括以下步驟的方法制備的(I)提供不表達朊蛋白的動物，所述動物為家畜；(2)用朊蛋白作為抗原免疫步驟(I)所述的動物，使所述動物產生所述抗體；(3)收集含有所述抗體的動物血清，獲得本專利技術第一方面所述的抗體。在本專利技術的第二方面，提供了本專利技術第一方面所述抗體的用途，所述抗體用于(i)檢測待測樣本是否感染朊蛋白或朊病毒； (ii)制備檢測待測樣本是否感染朊蛋白或朊病毒的試劑。在本專利技術的第三方面，提供了一種制備本專利技術第一方面所述抗體的方法，包括步驟(I)提供不表達朊蛋白的動物，所述動物為家畜；(2)用朊蛋白作為抗原免疫步驟(I)所述的動物，使所述動物產生所述抗體；(3)收集含有所述抗體的動物血清，獲得本專利技術第一方面所述的抗體。在另一優選例中，所述不表達朊蛋白的動物為朊蛋白基因敲除的動物、朊蛋白基因沉默的動物，或朊蛋白基因突變、朊蛋白基因缺失不表達朊蛋白的動物，或其組合。在另一優選例中，所述不表達朊蛋白的動物，其朊蛋白的閱讀框被外源插入的新霉素序列破壞。在另一優選例中，所述朊蛋白基因敲除動物為朊蛋白雙等位基因都缺失的轉基因動物。在另一優選例中，所述的不表達朊蛋白的動物選自下組豬、牛、羊、貓、兔、鹿，較佳地為牛或羊，更佳地為羊。在另一優選例中，所述的朊蛋白為外源重組的動物朊蛋白。在另一優選例中，所述的朊蛋白為原核表達的重組動物朊蛋白，較佳地，為豬、牛、羊、兔的朊蛋白，更佳地，為羊朊蛋白。在另一優選例中，所述朊蛋白是通過包括以下步驟的方法制備的(A)以家畜基因組DNA為模板，體外擴增獲得朊蛋白編碼基因；(B)將家畜朊蛋白編碼基因插入原核表達載體，構建重組表達質粒；(C)將所述質粒轉化宿主菌；(D)在合適的條件下培養家畜朊蛋白編碼基因轉入成功的宿主菌；(E)分離純化步驟(Vi)所述宿主菌的表達產物，獲得目的朊蛋白。在另一優選例中，原核表達載體為pET22b。在另一優選例中，原核宿主菌為大腸桿菌。在本專利技術的第四方面，提供了一種檢測待測樣本是否感染朊蛋白或朊病毒的方法，包括步驟(A)將本專利技術第一方面所述的抗體與待測樣本接觸，以便使得所述抗體與朊蛋白形成復合物；(B)檢測待測樣本中是否形成所述復合物。在另一優選例中，所述的復合物包括抗體與游離的或位于朊病毒上的朊蛋白所形成的復合物。在本專利技術的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有效量本專利技術第一方面所述的抗體。在另一優選例中，所述的藥物組合物還包括至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。應理解，在本專利技術范圍內中，本專利技術的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明下列附圖用于說明本專利技術的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本專利技術范圍。 圖1顯示了羊朊蛋白基因擴增產物電泳結果，可見擴增出700bp的羊PrP條帶，與預期相符。圖2顯示了重組質粒pET-22b-PrP的酶切鑒定結果，可見切出700bp大小的羊PrP條帶，與預期相符。圖3顯示了原核表達蛋白SDS-PAGE電泳結果。圖4顯示了純化重組蛋白Western-blot印跡圖。圖5顯示了羊朊蛋白多克隆抗體應用于羊腦中朊蛋白的檢測Western-blot印跡結果。圖6顯示了羊朊蛋白多克隆抗體應用于鼠腦中朊蛋白及朊病毒檢測Western-blot 印跡結果。具體實施例方式本專利技術人經過廣泛而深入的研究，意外地分析，使用朊蛋白免疫不表達朊蛋白的動物，可以制備得到一種高效價的朊蛋白抗體，具體地，所述抗體具有以下特征由不表達朊蛋白的動物所產生的，并且特異性針對該種動物的朊蛋白；所述抗體與所述動物的朊蛋白的結合效價大于10000 ;其中，所述動物為家畜。本專利技術還提供了制備所述抗體的方法及其應用。在此基礎上完成了本專利技術。Prion 疾病Prion疾病的致病因子是一種具有傳染性的蛋白質，又稱之為朊病毒。人和非人哺乳動物中存在朊蛋白基因，該基因為單拷貝基因本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的、特異性與朊蛋白結合的抗體，其特征在于，所述的抗體具有以下特征：(a)由不表達朊蛋白的動物所產生的，并且特異性針對該種動物的朊蛋白；(b)所述抗體與所述動物的朊蛋白的結合效價大于10000；其中，所述動物為家畜。

【技術特征摘要】
1.一種分離的、特異性與朊蛋白結合的抗體，其特征在于，所述的抗體具有以下特征 (a)由不表達朊蛋白的動物所產生的，并且特異性針對該種動物的朊蛋白； (b)所述抗體與所述動物的朊蛋白的結合效價大于10000； 其中，所述動物為家畜。2.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗血清。3.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體由不表達朊蛋白的羊產生且特異性針對羊的朊蛋白。4.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體的效價大于12000。5.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體是通過包括以下步驟的方法制備的 (1)提供不表達朊蛋白的動物，所述動物為家畜； (2)用朊蛋白作為抗原免疫步驟(I)所述的動物，使所述動物產生所述抗體； (3)收集含有所述抗體的動物血清,獲得權利要求1所述的抗體。6.權利要求1所述抗體的用途，其特征在于，用...

【專利技術屬性】
技術研發人員：成國祥，俞慧清，陳建泉，王學斌，
申請(專利權)人：上海轉基因研究中心，上海杰隆生物工程股份有限公司，
類型：發明
國別省市：