創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲ELISA試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體及抗原捕獲ELISA試劑盒。該創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC?No.6755的雜交瘤細胞株分泌產生。該創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體可用于檢測創傷弧菌。本發明專利技術還公開了一種創傷弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于免疫學領域，具體涉及一種創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，雜交瘤細胞株及抗原捕獲ELISA試劑盒。
技術介紹
創傷弧菌(Vibrio vulnificus，VV)是一種嗜鹽弧菌，廣泛存在于海水及海產品中，人體可通過生食海鮮或經過肢體破損創口接觸海水、海產品而受其感染。常見于海上勞作的漁民及駐海演習人員從而引起敗血癥和軟組織感染。本菌對于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎、肝功能障礙患者的危害相當嚴重，可引起創傷弧菌膿毒血癥，起病急，進展迅速，死亡率高。快速準確的早期診斷是指導臨床正確用藥從而達到理想治療效果的有力保證；同時，創傷弧菌的治療手段仍為經驗性的抗生素應用，然而，隨著細菌對抗生素逐漸出現的不同程度的耐藥現象，找到一種非大劑量應用抗生素的治療也成為亟待解決的問題。單克隆抗體用于疾病的診斷、治療已在醫學領域及檢驗檢疫領域得到廣泛開展，并收到了很好的效果。作為我國海域主要致病菌之一的創傷弧菌，至今鮮有診斷與治療的單克隆抗體制劑問世，為了解決該菌感染的診斷及防治問題，本研究對其單克隆抗體進行了研究。目前檢測食品中致病微生物的方法主要以傳統方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時間長，一般情況下需要5-7天，有時達到10-15天，很難滿足快速鑒定的需要；近幾年發展起來的PCR技術，是一種快速、靈敏、特異性好的技術，但是目前該技術還是依賴于傳統方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，從而影響PCR的擴增結果；以抗體為基礎的免疫學檢測已經成為食品中 有毒有害物質及有害生物檢測不可或缺的重要技術手段。目前已經發展了多種特異性免疫學檢測技術，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)、化學發光免疫分析(CIA)、生物發光免疫分析(BIA)、免疫沉淀反應、免疫凝集反應、ELISA檢測試劑盒、免疫膠體金試紙條、免疫乳膠檢測試劑等。其中ELISA檢測試劑盒、免疫膠體金試紙條等多種以抗體為基礎的免疫學檢測技術，以其簡便、快速、靈敏、準確、實用的特點一直是國境檢驗檢疫安全偵檢技術體系中的重要組成，已經成為有害生物及有毒有害物質檢測不可或缺的重要技術手段。快速的ELISA方法檢測，作為篩選方法具有快速、靈敏的特點，是受到廣泛歡迎的篩選方法，但是所使用的試劑盒均來自國外，價格昂貴，而且需要配備其專門的儀器。因而，研究開發具有自主知識產權的食源性致病微生物的抗體,是開發擁有自主知識產權的ELISA檢測方法、膠體金檢測方法、基于免疫反應為基礎的免疫納米磁珠富集方法的基礎。鞭毛是創傷弧菌的一個重要毒力因子，具有特異性的鞭毛抗原(H抗原)，常作為血清學鑒定的依據之一。細菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物學和致病機制研究中具有重要的意義。例如，鞭毛蛋白被認為是一種保護性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究結果表明，鞭毛蛋白可作為天然免疫應答的誘導劑，誘導產生的天然免疫應答可幫助建立針對外源抗原的獲得性免疫應答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。在已往的創傷弧菌單克隆抗體的制備過程中，多使用滅活的VV菌體作為抗原，而菌體的大部分蛋白為菌屬共有蛋白，不具有種間特異性，導致收獲的單抗很難避免弧菌菌屬內的種間交叉反應。本研究選用具有種間特異性的鞭毛蛋白作為抗原，并且在陽性克隆篩選過程中排除交叉反應，制備特異性良好的VV單克隆抗體，并將其應用于制備創傷弧菌ELISA檢測試劑盒。
技術實現思路
本專利技術所要解決的第一個技術問題是提供一種創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體可以用于檢測創傷弧菌。本專利技術所要解決的第二個技術問題是提供一種創傷弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒。為解決上述技術問題，本專利技術所提供的技術方案如下本專利技術所提供的創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No. 6755的小鼠雜交瘤細胞株分泌產生。該小鼠雜交瘤細胞株已于2012年11月I日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，其保藏編號為CGMCC No. 6755，分類命名為抗創傷弧菌(Vibix)vulnificus)雜交瘤細胞株。保藏編號為CGMCC No. 6755的小鼠雜交瘤細胞株也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術還提供了一種創傷弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，該試劑盒包括已包被創傷弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標記的本專利技術所述的單克隆抗體。所述酶優選為辣根過氧化酶。進一步地，為了便于檢測，本專利技術試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，以及ELISA反應所需的 酶聯免疫檢測試劑。其中，所述陽性對照為創傷弧菌鞭毛蛋白，所述陰性對照為未免疫創傷弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀釋液。所述酶聯免疫檢測試齊U，均為常規的酶聯免疫檢測試劑，包括但不限于，酶的底物反應液、洗滌液和反應終止液。本專利技術具有以下優點和效果首先，本專利技術通過特異性實驗，包括30株副溶血性弧菌、30株霍亂弧菌和27株非創傷標準菌株，其中包括大部分常見的病原菌，其特異性驗證的廣度遠大于其他創傷弧菌單克隆抗體的驗證。重要的是，本專利技術的創傷弧菌單克隆抗體顯示出良好的特異性和穩定性。其次，敏感性實驗結果表明本專利技術試劑盒的檢測敏感性為IO3/ L，目前在國內外已商業化生產的試劑盒，其靈敏度基本在IO4/孔左右，因此，本專利技術的檢測靈敏度高于其他試劑盒檢測的平均水平，具有理想的應用前景。與微生物傳統檢測方法相比，本專利技術的ELISA檢測方法與其檢測靈敏度相當，但將檢測周期從7 10天縮短至f 2天，并且具有快速、高效等優點。附圖說明圖1.創傷弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE圖；泳道1:創傷弧菌鞭毛蛋白；泳道2 :蛋白Marker ；圖2.創傷弧菌ATCC17802鞭毛蛋白電鏡；圖3. mAb 的 SDS-PAGE 圖；泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :mAb。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的制備1.菌體培養及鞭毛蛋白的提取創傷弧菌(Vibriovulnificus, VV) (ATCC 1758，實驗室保存)接種于 TlNl 培養基(購自北京陸橋技術有限責任公司，貨號CM168), 36°C活化24h ;挑取單菌落接種于含2%NaCl的TSA培養基(購自北京陸橋技術有限責任公司，貨號CM417)生長18 24h ;用無菌棉簽將生長良好的菌落均勻涂布在TSA (2%NaCl)培養基上，36°C培養18±2h。次日用無菌棉簽刮下菌體懸浮于預冷的0. 15M NaCl溶液中，冰浴15 30min，IOOOrpm勻漿45sec，立即置于冰上lOmin。勻漿液4°C條件下IOOOOrpm離心IOmin ;取上清液4°C條件下16000rpm離心 2h，棄上清，沉淀重懸于 TET (IOmM Tris, 2mM EDTA，pH 8. 0, l%Triton X-100)緩沖液中。離心過程重復3次。操作過程保持低溫下進行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(0.1M Tris, 0.1mM EDTA，pH 7. 8) buffer 中，4°C保存備用。 2. SDS-PAGE 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC?No.6755的雜交瘤細胞株分泌產生。

【技術特征摘要】
1.創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo. 6755的雜交瘤細胞株分泌產生。2.分泌產生創傷弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCCNo.6755。3.—種創傷弧菌鞭毛蛋白捕獲ELISA試劑盒，其特征在于，包括已包被創傷弧菌鞭毛蛋白多克隆抗體的固相載體和酶標記的權利要求1所述的單克隆抗體。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化酶...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾靜，張西萌，張蕾，魏海燕，周熙城，劉莉，
申請(專利權)人：北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：