一種兔抗牛αs -酪蛋白多克隆抗體的制備方法技術

本發明專利技術提供了一種兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗體的制備方法，為鑒定奶牛乳腺組織合成的αs-酪蛋白提供試驗材料。本發明專利技術選用健康新西蘭大白兔每兩周免疫一次奶牛αs-酪蛋白，待抗血清達到效價后，對兔進行頸動脈放血并分離血清，利用飽和硫酸銨法（鹽析）結合蛋白A樹脂（親和層析）純化抗體，分別用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫印跡（Western-blot）法鑒定純化后抗體的純度和特異性。抗血清經過飽和硫酸銨和蛋白A樹脂兩步純化不僅得到了純度較高的抗體，而且延長了蛋白Ａ樹脂的使用壽命，節約了成本。純化得到的抗體可以特異性結合奶牛αs-酪蛋白，為進一步研究奶牛αs-酪蛋白合成的調控提供了有效的科研工具。

【技術實現步驟摘要】
一種兔抗牛Cts-酪蛋白多克隆抗體的制備方法
本專利技術屬于生物工程
，涉及一種兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗體的制備方法。
技術介紹
近年來，人們對乳品質的要求越來越高，乳蛋白作為衡量乳品質的重要指標，其合成的營養調控已成為奶牛營養學研究的熱點。乳蛋白大部分是由奶牛乳腺上皮細胞從頭合成和分泌的，80%的乳蛋白由酪蛋白組成，而牛乳中的酪蛋白主要由a s-酪蛋白 (a s-casein)組成(約45%_55%),因此研究調控a s-酪蛋白的合成具有重要意義。檢測牛乳或乳腺細胞合成分泌的酪蛋白最常用的方法主要包括ELISA法和Western-blot法，而這兩種方法均需用到酪蛋白抗體，目前沒有商品化的奶牛as-酪蛋白抗體，因此本專利技術通過免疫新西蘭兔來制備兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗體，旨在為研究奶牛Cis-酪蛋白合成的調控提供有效的試驗材料。為得到純度較高、特異性較強的抗體，本專利技術通過飽和硫酸銨和蛋白A樹脂對抗血清進行兩次純化，純化后得到的抗體用Western-blot法鑒定其與a s-酪蛋白純品及乳腺組織中a s-酪蛋白的有無特異性反應。
技術實現思路
本專利技術的目的是建立一種兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗體的制備方法，為鑒定奶牛乳腺組織合成的a s-酪蛋白提供試驗材料。為實現上述目的，具體的實施方案為選用健康新西蘭大白兔每兩周免疫一次奶牛a s-酪蛋白，待血清達到抗體效價后，對兔進行頸動脈放血并分離血清，利用飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂純化抗體。分別用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western-blot)法鑒定純化后抗體的純度和特異性，最后用Western-blot法鑒定該抗體其與奶牛乳腺組織合成的a s-酪蛋白的反應性。本專利技術步驟如下步驟(I).免疫動物用a s_釀蛋白純品對免疫動物(新西蘭大白兔)實施每兩周一次的免疫程序，初免使用弗氏完全佐劑，以后使用弗氏不完全佐劑。步驟(2).取動脈血取免疫動物動脈血，離心分離血清，超低溫冰箱保存備用。步驟(3).抗體純化用飽和硫酸銨法對血清進行初步純化，然后用蛋白A樹脂進一步純化得抗體。抗體純度鑒定=SDS-PAGE分離純化后的抗體，凝膠成像系統拍照觀察其條帶，據此判斷純化后抗體的純度。抗體效價測定=ELISA測定抗體效價，酶標板用a s-酪蛋白純品包被，取不同稀釋度的純化后的抗體進行孵育，二抗孵育后，加入底物溶液和終止液在酶標儀上測定并讀取吸光值。抗體特異性鑒定Western-blot法鑒定純化后的抗體與a s-酪蛋白及乳腺組織合成的as-酪蛋白的反應性，SAS-PADE電泳結束后進行切膠，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育， DAB顯色劑顯色，掃描觀察結果。盡管蛋白A樹脂純化多克隆抗體得到的免疫球蛋白純度較高，但這種樹脂價格昂貴，而且多次反復使用后與免疫球蛋白的結合活性降低，因此，為了提高蛋白A樹脂的使用壽命和節約成本，本專利技術先用飽和硫酸銨對抗體進行粗提純后再用蛋白A樹脂進行親和層析純化，最終得到了純度較高的抗體，而且能夠特異性與as-酪蛋白發生抗原抗體結合反應，并成功用于鑒定奶牛乳腺組織中as-酪蛋白的合成。附圖說明圖I是SDS-PAGE結果。圖 2 是 Western-blot 結果。圖3是抗體在檢測奶牛乳腺組織a s-酪蛋白合成上的應用。具體實施方式I材料與方法I. I試驗材料a s-酪蛋白標準品(美國Sigma公司，純度彡70%);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)；蛋白A樹脂(美國Genscript公司)；羊抗兔IgG HRP (武漢博士德公司)；豬源明膠(美國Amresco公司)；DAB顯色劑(上海生工生物工程公司)；RIPA裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)I. 2試驗動物及飼養試驗動物選用4只健康純種新西蘭大白兔(購自南京金陵種兔廠)，飼養前對兔舍進行徹底清掃和消毒，采用單籠飼養，每日飼喂顆粒飼料(飼料成分不含酪蛋白)3次，自由飲水。待兔適應飼養環境約一周后，耳緣靜脈采血約ImL進行ELISA測試其血清是否與 a s-酪蛋白有反應性，無反應性的合格兔子按免疫程序進行免疫。L 3免疫程序免疫程序見表1，每次免疫前將弗氏佐劑與a s-酪蛋白溶液按I: I徹底混合乳化后，采用皮下多點注射法，每只兔注射ImL乳化液(含800 μ g a s_酪蛋白)。免疫結束后的第 57天耳緣靜脈采血，參考楊苗等(2010)的方法ELISA檢測抗血清效價，效價達到1:10000 時立即準備放血。 表I a s-酪蛋白免疫程序本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種兔抗牛αs?酪蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，選用健康新西蘭大白兔每兩周免疫一次奶牛αs?酪蛋白，待血清達到抗體效價后，取兔動脈血并分離血清，利用飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂純化抗體。

【技術特征摘要】
1.一種兔抗牛a s-酪蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，選用健康新西蘭大白兔每兩周免疫一次奶牛a s_酪蛋白，待血清達到抗體效價后，取兔動脈血并分離血清，利用飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂純化抗體。2.根據權利要求I所述兔抗牛as-酪蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法具體步驟為 步驟(I).免疫動物用a s_釀蛋白純品對健康新西蘭大白兔實施每...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王洪榮，龐學燕，季昀，喻禮懷，王夢芝，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：