本發明專利技術公開了一種抑制移植器官慢性排斥反應的抗體的制備及純化方法，包括以下步驟：步驟一，用淋巴細胞分離液收集外周血單核細胞，20ng/mlrMICA誘導培養；步驟二，用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取單個核細胞蛋白質；步驟三，串聯高效液相層析（HPLC）純化抗MICA抗體；步驟四，抗MICA抗體的鑒定：利用rMICA，用WesternBlot進行反向驗證。利用本發明專利技術的方法所得到的抗MICA抗體，能夠通過封閉內源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制內源性MICA基因表達，從而達到阻斷移植器官MICA表達的效果，即在器官移植術后有效降低供體器官中MICA基因及其蛋白的表達。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
自上世紀50年代美國成功實施世界上首例腎移植以來，器官移植作為一項劃時代的新技術在過去的50多年中得到了蓬勃發展，特別是隨著八十年代末免疫抑制劑的出現，更是極大地提高了器官移植的成功率和受者的存活率，至今全球大約已經有60多萬患者接受了包括腎、肝、心在內的器官移植手術。我國從上世紀60年代開展器官移植以來，至2006年全國年器官移植數已位居全球第二位，取得了長足的進步和發展。移植物發生免疫排斥反應是自器官移植出現后就一直困擾著國內外學者的最大瓶頸，雖然移植免疫機制的研究在不斷深入，大量新免疫抑制藥物在不斷涌現，但是不可否認目前國內外依然面臨著如移植后移植物發生免疫排斥機率仍然較高，免疫抑制劑費用昂貴及長期應用后發生腫瘤、感染的機會大大增加等諸多問題。 多年來的移植免疫研究表明，移植成功與否的關鍵取決于供、受者間組織相容性抗原是否一致或相近。一直以來，學界都將研究重點放在了經典的主要組織相容性復合體(major histocompability complex, MHC),即 MHC-I 和 MHC-II 上，并建立了經典的免疫排斥理論即同種異基因個體間移植后，受者T細胞通過直接或間接兩條途徑，在協同刺激因子的作用下獲得激活，從而發動一系列免疫應答，且認為體液免疫是超急性排斥反應和加速急性排斥反應的主導機制；而急性排斥反應和慢性排斥反應主要由細胞免疫反應機制參與。因此以往在同種異體器官移植前往往需要進行供受體間的經典MHC交叉配型(主要是HLA-A, HLA-B和HLA-DR)試驗，國內外的臨床實驗也證明了移植前經典MHC交叉配型陰性的受者和交叉配型陽性的受者相比，前者在移植物免疫排斥發生率上明顯低于后者。但是后來有研究人員發現一些即使是經典MHC交叉配型一致的受者在移植后，也不能完全避免急性或慢性免疫排斥反應的發生，并且在一些腎移植前的受者體內發現了抗同種異型HLA抗體(IgG、IgM) ，提示這些抗體可能在移植腎免疫排斥發生機制中起重要作用。有學者據此提出了體液學說，即急性或慢性移植免疫排斥反應可能由受者體內存在的供體特異性的同種異型抗原抗體所介導，認為以供體特異性抗體與供體移植物抗原結合作為最初的觸發點，引起了一系列級聯反應最后導致移植物損傷、失去功能。在一些發生急性或慢性排斥反應的移植腎的病理檢查中發現C4d的沉積恰好部分論證了該學說。有意思的是，在另外一些術前同樣經過經典HLA交叉配型，且抗HLA抗體檢測陰性卻依然發生了急性或慢性排斥反應的受體體內，發現了大量激活的NK細胞和T細胞,說明細胞免疫反應機制的存在。近來美國學者在一些腎移植術前和術后患者的血清中均發現了抗MICA蛋白抗體，隨后又在出現排斥反應被切除的移植腎中發現了更高滴度的該抗體，提示此類患者在腎移植前體內存在同種異型MICA抗原的預致敏，且抗MICA蛋白抗體在腎移植后發生的排斥反應中可能起著重要作用。但目前國內外尚未發現有針對MICA抑制器官移植術后慢性排斥反應的方法存在。目前國內外對于MICA移植免疫的研究仍然存在一些空白點①在封閉移植物經典MHC分子的條件下，仍然有部分移植物發生了急慢性排斥反應，表明有其它尚未知曉的因素引起或參與了該反應，而MICA可能是其中比較重要的因素之一。②雖然在一些腎移植前后體內及發生免疫排斥反應的臟器灌洗液中均發現了抗MICA抗體，但關于MICA參與的移植免疫排斥反應機制仍然不清楚，且目前大多研究主要集中在腎移植的細胞和分子水平，缺少其他器官如肝移植和大型動物的體內模型研究；③國內外研究者在腎移植患者發生急性或慢性排斥后切除的腎臟病理切片中發現了大量的C4d的沉積，說明存在經典的補體激活，即意味著體液免疫反應的出現，這表明以往細胞免疫機制介導急慢性排斥反應的單控移植免疫機制存在缺陷。
技術實現思路
為了克服因MICA過表達引起器官移植后慢性排斥反應的問題，本專利技術提供，使用本專利技術所述的制備及純化方法所得到的抗MICA抗體，能夠通過封閉內源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制內源性MICA基因表達，從而達到阻斷移植器官MICA表達的效果。 為實現上述目的，本專利技術可采取下述技術方案 本專利技術，包括以下步驟 步驟一 用淋巴細胞分離液收集外周血單核細胞，體外培養擴增，20ng/ml rMICA誘導培養，收集培養細胞； 步驟二 用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取單個核細胞蛋白質； 步驟三 串聯高效液相層析(HPLC)純化抗MICA抗體它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失； 步驟四 抗MICA抗體的鑒定利用rMICA,用Western Blot進行反向驗證。有益效果利用本專利技術的方法所得到的抗MICA抗體，能夠通過封閉內源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制內源性MICA基因表達，從而達到阻斷移植器官MICA表達的效果，SP在器官移植術后有效降低供體器官中MICA基因及其蛋白的表達。附圖說明圖I為本專利技術試驗例供體抗MICA抗體封閉處理后血清MICA表達的實驗結果圖。具體實施例方式本專利技術，包括以下步驟 步驟一 用淋巴細胞分離液(天津TBD)收集外周血單核細胞，體外培養擴增，20ng/ml rMICA誘導培養，收集培養細胞。具體做法是，體外外周靜脈血30ml，先用生理鹽水稀釋后，然后使用淋巴細胞分離液分離出灰白色淋巴細胞層，用PBS液對所述灰白色淋巴細胞層洗滌，在該過程中，使用臺盼蘭計數單個核細胞活性；利用TRIZOL (新型總RNA抽提試劑)提取經步驟一處理的灰白色淋巴細胞的RNA,利用PCR技術(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)合成和擴增特異性MICA基因片段，KpnI和XboI限制性內切酶切取所需要片段克隆入pEnter_3C質粒，經過序列篩選后利用Baculovirus Expression System and Gateway技術直接植入桿狀病毒基因組內，重組的桿狀病毒DNA轉染S9f昆蟲細胞，收集病毒后放入無血清的EXPRESS FIVE SFM 培養基中，3 天后用 50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，離心獲取上清后用鎳親和力瓊脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRIC0N超濾器過濾(具體方法詳見本申請人于2011年I月10日的專利申請《一種可溶性人重組MICA蛋白的制備方法》，申請號為 201110003536. 5)。步驟二 用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術研究所提供)提取單個核細胞蛋白質 a.每20微升細胞沉淀加入200微升細胞漿蛋白抽提試劑A； b.最高速劇烈震蕩5秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開； c.冰浴15分鐘； d.加入細胞漿蛋白抽提試劑B10微升。最高速劇烈震蕩5秒，冰浴I分鐘； e.最高速劇烈震蕩5秒，4°C12，000-16，OOOg離心5分鐘； f.立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。步驟三 串聯高效液相層析(HPLC)純化抗MICA抗體它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抑制移植器官慢性排斥反應的抗體的制備及純化方法，其特征在于包括以下步驟：步驟一：用淋巴細胞分離液收集外周血單核細胞，體外培養擴增，20ng/ml？rMICA誘導培養，收集培養細胞；步驟二：用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取單個核細胞蛋白質；步驟三：串聯高效液相層析（HPLC）純化抗MICA抗體：它利用不同分離模式的結合，使混合物中的肽得到更大程度的分離，并且降低低豐度肽的丟失；步驟四：抗MICA抗體的鑒定：利用rMICA，用Western？Blot進行反向驗證。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹利平，丁國平，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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