TRAIL R2-特異性多聚體支架制造技術

本發明專利技術提供了特異性結合TRAIL受體2(TRAIL?R2)(參與細胞凋亡的細胞膜受體)的基于腱糖蛋白-3FnIII結構域的多聚體支架。本發明專利技術還提供了具有增強的對于靶的親和力、增強的穩定性和減小的免疫原性的工程變體。此外，本發明專利技術還涉及作為預防劑、治療劑或診斷劑的工程多價支架以及它們抗由表達TRAIL?R2的細胞引起的疾病的用途，特別地涉及抗癌的治療性用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】TRAILR2-特異性多聚體支架專利技術背景參考序列表本申請通過引用以標題為“2943.011PC02_sequence_listing.txt”的文本文件(于2011年4月12日創建的并且大小為211千字節)與本申請一起通過EFS-Web提交的序列表將其并入本文。專利
本專利技術總體上涉及抗體模擬物的領域，具體地涉及用于例如產生具有新型結合特征的產物的基于纖連蛋白III型(Fn3)結構域的多聚體支架。具體地，本專利技術涉及衍生自人胰糖蛋白C的第3FnIII結構域的TRAILR2-特異性多聚體支架，以及它們用于TRAILR2受體檢測和TRAILR2-介導的功能的調節例如癌癥和其它障礙的治療的用途。背景領域能夠特異性結合期望的靶表位的生物分子具有作為治療劑、研究和醫學診斷工具的極大重要性。該類分子的公知實例為抗體。可選擇特異性結合幾乎任何結構表位和具有對于所述表位的親和力的抗體。然而，經典抗體是難以在簡單真核系統中表達的結構復雜的異源四聚體分子。因此，大多數抗體使用復雜且昂貴的哺乳動物細胞表達系統來產生。具有相對確定的三維結構的蛋白質(通常稱為蛋白質支架)可用作用于設計工程產物的試劑。其中這類支架是有用的一個具體領域是抗體模擬物設計的領域。抗體模擬物，即小的非抗體蛋白質治療劑，利用抗體和抗體片段的有利方面，例如對靶的高親和力結合以及低免疫原性和毒性，同時避免一些缺點，例如抗體片段聚集的傾向以及不如全長IgG穩定。這些缺點可通過使用通過除去抗體天然折疊的部分產生的抗體片段來解決。然而，當通常包埋在疏水環境例如可變結構域與恒定結構域之間的界面中的氨基酸殘基變得暴露于溶液時，這通常引起聚集。基于支架的抗體模擬物的一個實例基于III型(FnIII)的纖連蛋白模塊(在門(phyla)間和蛋白質種類間(例如在哺乳動物的血液和結構蛋白質中)被廣泛發現的結構域)的結構。TRAIL(腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體，在文獻中也稱為Apo2L和TNFSF10)屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族并且已被鑒定為腫瘤細胞的程序化細胞死亡或細胞凋亡的激活物。TRAIL的膜結合和可溶性形式都能夠通過與位于靶細胞上的TRAIL受體相互作用來觸發細胞凋亡。在人中，已鑒定了5個受體具有對TRAIL的結合活性。在TRAIL對TRAILR1或TRAILR2結合后，觸發了半胱天冬酶相關的細胞死亡。鑒于該細胞死亡活性，正在尋找基于TRAIL的治療方法。已開發了幾種基于TRAIL或TRAILR1或R2人激動抗體的治療性方法，然而，TRAIL具有極短的壽命，其結合誘餌受體，并且抗體的大尺寸可限制它們的腫瘤滲透。因此，存在對可結合TRAIL受體的新型分子、包含此類分子的藥物組合物、用于篩選此類分子的方法以及用于在許多癌癥的治療性治療中使用此類分子的方法的需要。本文中的參考資料的引述或論述不應當被解釋為這對于本專利技術是現有技術的承認。專利技術概述本專利技術提供了包含2個Tn3單體支架的TRAILR2-特異性重組多聚體支架，其中(a)每一個Tn3單體支架包含命名為A、B、C、D、E、F和G的7個β鏈，和6個命名為AB、BC、CD、DE、EF和FG的環區域，(b)Tn3單體支架以串聯形式連接，以及(c)重組多聚體支架特異性結合TRAILR2。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架包含3、4、5、6、7或8個Tn3單體支架。在一些其它實施方案中，本專利技術的TRAILR2-特異性多聚體支架中的所有Tn3單體支架以串聯形式存在。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架的至少一個Tn3單體支架通過接頭或通過異源部分直接連接于1、2、3、4、5、6或7個其它Tn3單體支架。在某些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架直接連接而無間插在Tn3單體支架之間的接頭。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架的至少2個Tn3單體支架通過接頭連接。在一些實施方案中，接頭包含肽接頭。在一些實施方案中，肽接頭是柔性肽接頭。在某些實施方案中，肽接頭包含(GxS)y序列，其中x和y為整數，其中x=1、2、3或4，并且其中y=1、2、3、4、5、6或7。在一些實施方案中，本專利技術的TRAILR2-特異性多聚體支架對TRAILR2的結合與TRAILR2特異性Tn3單體支架的所述結合相比較得到了增強。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架對TRAILR2的結合與TRAILR2特異性Tn3單體支架的所述結合相比較增強了對靶的作用。在一些實施方案中，本專利技術的TRAILR2特異性支架對TRAILR2的結合相對TRAILR2特異性Tn3單體支架的所述結合的增強是結合親和力的增強和/或結合親合力的增強。在其它實施方案中，對于TRAILR2的結合親和力和蛋白質穩定性相對于TRAILR2特異性Tn3單體支架的所述結合親和力和蛋白質穩定性得到了增強。在一些實施方案中，對于TRAILR2的結合親合力和蛋白質穩定性相對于TRAILR2特異性Tn3單體支架的所述親合力和蛋白質穩定性得到了增強。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架包含含有功能性部分的接頭。在一些實施方案中，功能性部分為免疫球蛋白或其片段。在某些實施方案中，免疫球蛋白或其片段選自：Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、scFv、雙鏈抗體、線性抗體、全長抗體、Fc區域及所述部分的兩個或更多個的組合。在某些實施方案中，免疫球蛋白或其片段包含IgG的Fc結構域和鉸鏈區。在其它實施方案中，免疫球蛋白或其片段還包含CH1結構域。在一些實施方案中，免疫球蛋白或其片段包含Cκ結合域或Cλ結構域。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架的Tn3單體支架的至少一個融合于異源部分。在一些實施方案中，異源部分包含選自如下物質的組合物：蛋白質、肽、蛋白質結構域、接頭、藥物、毒素、細胞毒素劑、成像劑、放射性核素、放射性化合物、有機聚合物、無機聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSAFcRn結合部分、抗體、抗體的結構域、抗體片段、單鏈抗體、結構域抗體、白蛋白結合結構域、酶、配體、受體、結合肽、非-FnIII支架、附加表位、重組多肽聚合物、細胞因子以及所述部分的兩種或更多種的組合。在一些具體實施方案中，將TRAILR2-特異性多聚體支架綴合于PEG。在其它實施方案中，超過2個Tn3單體支架通過接頭連接并且至少一個接頭在結構上和/或功能上與另外的接頭不同。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架中的Tn3單體支架以分枝形式連接。在其它實施方案中，本專利技術的TRAILR2-特異性多聚體支架中的一些Tn3單體支架以線性串聯方式連接并且一些Tn3單體支架以分枝形式連接。在一些實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架中的至少2個Tn3單體支架是相同的。在其它實施方案中，TRAILR2-特異性多聚體支架中的至少2個Tn3單體支架是不同的。在一些實施方案中，本專利技術的TRAILR2-特異性多聚體支架結合至少另外的靶，其可以是T細胞抗原。在一些實施方案中，該T細胞抗原為CD40L。在一些實施方案中，本專利技術的TRAILR2-特異性多聚體支架為受體激動本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.04.13 US 61/323,7081.一種包含以線性串聯形式連接的六個TRAILR2特異性Tn3單體支架的TRAILR2-特異性重組多聚體支架，其中(a)每一個Tn3單體支架包含命名為A、B、C、D、E、F和G的7個β鏈，連接命名為AB、BC、CD、DE、EF和FG的6個環區域，其中：(i)AB環是SEQID：35的序列，BC環是SEQIDNO：97序列，CD環是SEQIDNO：37的序列，DE環是SEQIDNO：179的序列，EF環是SEQIDNO：39的序列，FG環是SEQIDNO：170的序列，(ii)AB環是SEQID：35的序列，BC環是SEQIDNO：97序列，CD環是SEQIDNO：37的序列，DE環是SEQIDNO：102的序列，EF環是SEQIDNO：39的序列，FG環是SEQIDNO：106的序列，(iii)AB環是SEQID：35的序列，BC環是SEQIDNO：97序列，CD環是SEQIDNO：37的序列，DE環是SEQIDNO：102的序列，EF環是SEQIDNO：39的序列，FG環是SEQIDNO：108的序列，或(iv)AB環是SEQID：35的序列，BC環是SEQIDNO：97序列，CD環是SEQIDNO：37的序列，DE環是SEQIDNO：102的序列，EF環是SEQIDNO：39的序列，FG環是SEQIDNO：170的序列，且β鏈A、B、C、D、E、F和G的序列分別為IEV、ALITW、CELAYGI、TTIDL、YSI、YEVSLIC和KETFTT；(b)所述Tn3單體支架以線性串聯形式連接；(c)所述重組多聚體支架特異性結合TRAILR2；且(d)所述Tn3單體支架具有至少一個二硫鍵來連接所述7個β鏈其中兩個。2.根據權利要求1所述的多聚體支架，其中所述多聚體支架包含7或8個TRAILR2特異性Tn3單體支架。3.根據權利要求1所述的多聚體支架，其中至少2個Tn3單體支架直接連接而無間插在所述Tn3單體支架之間的接頭。4.根據權利要求1所述的多聚體支架，其中至少2個Tn3單體支架通過接頭連接。5.根據權利要求4所述的多聚體支架，其中所述接頭包括肽接頭。6.根據權利要求5所述的多聚體支架，其中所述肽接頭為柔性肽接頭。7.根據權利要求5所述的多聚體支架，其中所述肽接頭包含(GxS)y序列，其中x和y為整數，其中x＝1、2、3或4，并且其中y＝1、2、3、4、5、6或7。8.根據權利要求1-7中任一項所述的多聚體支架，其中，所述多聚體支架對于TRAILR2的結合與TRAILR2特異性Tn3單體支架對于TRAILR2的結合相比較得到了增強。9.根據權利要求1-7中任一項所述的多聚體支架，其中所述多聚體支架對于TRAILR2的結合與TRAILR2特異性Tn3單體支架對于TRAILR2的結合相比較增強了對所述靶的作用。10.根據權利要求8所述的多聚體支架，其中對TRAILR2的結合相對于TRAILR2特異性Tn3單體支架對于TRAILR2的結合的增強為結合親和力的增強和/或結合親合力的增強。11.根據權利要求8所述的多聚體支架，其中對于TRAILR2的結合親和力和蛋白質穩定性與TRAILR2特異性Tn3單體支架對于TRAILR2的結合親和力和蛋白質穩定性相比較得到了增強。12.根據權利要求8所述的多聚體支架，其中對于TRAILR2的結合親合力和蛋白質穩定性與TRAILR2特異性Tn3單體支架對于TRAILR2的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·巴卡，T·迪斯泰德，J·斯維斯，D·泰斯，
申請(專利權)人：米迪繆尼有限公司，
類型：
國別省市：