本發(fā)明專利技術涉及與人CGA氨基酸序列的第236到251位或第264到279位氨基酸序列表示的多肽中的表位有反應性的單克隆抗體。本發(fā)明專利技術還涉及這些單克隆抗體在CGA的免疫測定中的應用、包含這兩種抗體的任一種的免疫試劑、以及用于測定CGA的含有基于這兩種單克隆抗體的免疫試劑的檢驗試劑盒。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于測定嗜鉻粒蛋白A (CGA)的方法。它還涉及針對CGA的單克隆抗體和以其為基礎的、可被用于本專利技術的測定法的免疫試劑，以及用于CGA的測定方法中的檢驗試劑盒。
技術介紹
嗜鉻粒蛋白(CG)和分泌粒蛋白組成了與神經遞質和肽類激素共同儲存在大腦和彌散神經內分泌系統(tǒng)中的酸性蛋白質家族(Winkler, H. &Fischer-Colbrie, R.，1992)。雖然這些蛋白質是不同基因的產物，但它們共有ー些總體結構特性，例如豐富的酸性氨基酸殘基和作為翻譯后切割的潛在位置的幾對堿性氨基酸。CG與神經肽和激素在全身神經內分泌細胞中共同儲存和共同釋放。已經提出了 CG在激素顆粒產生和激素包裝中的作用。此外，CG可以被切割成較小的片段，所述片段表現(xiàn)出生物活性，例如抑制激素釋放、血管擴張和抗 微生物作用(Stridsberg M, 2000)。神經內分泌起源的腫瘤通常表現(xiàn)出CGA血清/血漿水平的提高(O，Connor, DT, Deftos LJ, 1986)。神經內分泌腫瘤起源于神經內分泌細胞，典型的神經內分泌腫瘤是類癌瘤、嗜鉻細胞瘤、神經母細胞瘤、小細胞肺癌、甲狀旁腺機能亢進腺瘤、垂體瘤和胰島瘤，并包括MENl和MEN2綜合征。這還包括不同的神經內分泌瘤綜合征，即胃泌素瘤、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、生長抑素瘤、產胰多肽(PP)瘤(PPomas)和無功能性神經內分泌瘤(Eriksson, B.等，2000)。對于這些腫瘤，已經證明CGA是最好的循環(huán)標志物(Bajetta, E.等,1999)。為此原因，希望有用于CGA的定性和定量測定的特異性的、準確而快速的測定法。已經報告了幾種CGA測定法。US 4，758，522涉及基于競爭分析法，使用標記的CGA和針對CGA的抗體來測量樣品中人CGA的方法。測定與抗體結合或未結合的標記CGA的量作為樣品中CGA的度量。CGA樣品可以得自內分泌腺或腎上腺來源的組織。EP1078266B1涉及基于使用與人CGA的145-234位序列中的表位特異性結合的至少ー種(單克隆或多克隆)抗體的CGA免疫測定法。更具體地，它涉及在CGA的免疫測定法中使用與人CGA的145-197位序列中的表位特異性結合的抗體和/或與219-234位序列中的表位特異性結合的抗體。任選，這兩種抗體的任ー種都可以在CGA測定法中與特異性結合人CGA的250-301位序列中表位的抗體相組合。本
中已知方法的缺點是假陽性或假陰性結果，這主要是由于與通常也靠近天然CGA存在的CGA衍生肽的交叉反應所致。使用多克隆抗體的測定法尤其苦于這樣的缺點。已經建議過使用單克隆抗體以便克服這個問題，然而，現(xiàn)有技術中所述的基于單克隆抗體的CGA測定法事實上執(zhí)行起來甚至還不如基于多克隆抗體的測定法。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術涉及克服或改善這些缺點的方法。本專利技術的免疫化學測定法基于CGA多肽與兩種新的和獨特的抗體的特異性結合，對其進行檢測。ー種抗體與CGA多肽的ー個表位特異性結合，另ー種抗體CGA多肽的另一個表位特異性結合。在一種實施方式中，本專利技術涉及CGA多肽的測定方法，所述方法包括將準備測定CGA的存在或量的樣品與ー組單克隆抗體反應，其中至少ー種單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 2表示)中的表位有反應性；并且其中至少ー種其他單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 3表示)中的表位有反應性。人CGA的氨基酸序列在此是指Konecki等人在1987年報告的439個氨基酸長的序列，并由SEQ ID NO I表示。術語CGA多肽意在指示人CGA的全長多肽序列或者其可用于診斷上面提到的任何疾病的片段。這樣的片段應該優(yōu)選至少包含與SEQ ID NO: I和SEQID N0:2所涵蓋的氨基酸序列的反應性單克隆抗體起反應的表位。 本專利技術的免疫化學測定法可以具有各種樣式。優(yōu)選，所述免疫測定法基于夾心樣式-CGA蛋白被夾在所述兩種獨特的抗體之間。用于檢測抗體與CGA特異性結合的適合的樣式舉例為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和放射免疫測定法(RIA)。其他檢測方法也可以適當?shù)厥褂谩８鶕愆`種實施方式，本專利技術涉及針對CGA并與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸表示的多肽中的表位有反應性的單克隆抗體。根據再ー種實施方式，本專利技術涉及針對CGA并與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸表示的多肽中的表位有反應性的單克隆抗體。本專利技術的又一種實施方式涉及用于本專利技術方法中的檢驗試劑盒。這樣的檢驗試劑盒包含基于至少兩種單克隆抗體的免疫試劑，一種與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸表不的多肽中的表位有反應性，另ー種與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸表示的多肽中的表位有反應性。每種抗體都可以作為捕獲抗體或作為檢測抗體使用。檢驗試劑盒中包含的免疫試劑取決于所述測定法的方法和樣式。在一種實施方式中，至少ー種抗體可以直接或間接同標記物結合，例如酶或放射性標志物。在另ー種實施方式中，至少ー種抗體可以同適合的固相結合，例如微量滴定板。在另ー種實施方式中，至少ー種抗體可以同通用的連接劑結合，例如生物素或鏈霉親和素(已知它們能夠互相結合)。在所述測定法之前或過程期間，可以應用這樣的連接劑將抗體與固相或與標記物間接結合。生產針對ー種所指定的CGA表位的單克隆抗體的細胞可以通過例如K(ihler和Milstein在1975年描述的方法獲得。本專利技術還涉及分別與人CGA氨基酸序列的236至251位和264至279位氨基酸序列表示的多肽中的表位有反應性的單克隆抗體。總之，本專利技術提供了與使用單克隆抗體的現(xiàn)有技術方法相比具有改善的特異性和靈敏度、同時避免了使用多克隆抗體的測定法的缺點的方法。附I /4CGA校準曲線圖2/4本專利技術的檢驗與商業(yè)檢驗(Dako)之間的比較圖3/4本專利技術的檢驗與商業(yè)檢驗(CIS-BIO)之間的比較圖4/4在NE0LISA中分析的，來自于107份神經內分泌患者血漿和120份獻血者血漿的血漿。基準面〈3. 0 (紅線)。實施例材料-涂有針對CGA的236-251位肽的單克隆抗體的微量滴定板(12x8)。-含有在稀釋劑中的人CGA的校準品。Call=0nmol/L (稀釋劑)，Cal 2=lnmol/L, Cal3=5nmol/L, Cal 4=15nmol/L, Cal 5=30nmol/L, Cal 6=50nmol/L。 -凍干的低對照(L)。-凍干的高對照⑶。-30mL 稀釋劑(Dil)。-150 ii L含有針對CGA的264-279位肽的HRP標記抗體的結合物。IOOx濃縮。-15mL結合緩沖液-15mL 底物 TMB.-15mL 終止溶液(0. 5M H2S04).-35mL洗滌溶液，20x濃縮嗜鉻粒蛋白A的ELISA方法程序所有溶液都在室溫下使用。在室溫(20-30° C)下執(zhí)行溫育。樣品稀釋和溫育所有樣品在轉移到檢驗板之前都在単獨的稀釋板中稀釋5x。校準品、低對照、高對照和患者血漿在使用之前全部用50 UL血漿+200 UL稀釋劑稀釋。然后，將其通過上下吸取進行徹底混合，然后一式兩份本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：麥茨·斯特里斯貝格，英韋·索馬林，
申請(專利權)人：歐羅診斷股份公司，
類型：
國別省市：
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