用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應用。本發明專利技術提供了用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原，是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產物。所述免疫原免疫動物得到的多克隆抗體也屬于本發明專利技術的保護范圍。所述多克隆抗體可用作包被抗原和/或檢測用一抗，從而用于檢測待測樣本中是否含有變性Bt蛋白。所述待測樣本可為煮熟的轉基因作物，轉基因作物加工得到的食品或飼料等。本發明專利技術對轉基因糧食作物的生物安全性評價具有實用價值，潛在社會效益巨大。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應用。
技術介紹
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲晶體蛋白(又稱Bt殺蟲晶體蛋白或Bt蛋白)具有抗蟲作用，因此其編碼基因(Bt基因)在轉基因棉花等作物上應用廣泛。根據編碼基因序列的同源性和編碼蛋白的殺蟲譜，Bt蛋白分為cry族和cryt族，每一族下又分為數量不等的亞類。目前在植物中表達的Bt基因有CrylAa基因、CrylAb基因、CrylAc基因、Cry2Aa基因、Cry3Bb基因和Cry9c等基因。中國市場上商業化的轉Bt基因作物中主要轉入了針對鱗翅目昆蟲幼蟲有毒性的CrylAc基因。用轉基因棉花籽粒生產棉籽油后，可以得到副產物棉籽餅，棉籽餅通常用作家禽或家畜的飼料。棉籽餅中，常常殘留有變性Bt蛋白，對家禽或家畜具有潛在的危害，從而可能對食用家禽或家畜的人類造成潛在的危害。應用目前國內外商業化的免疫檢測試劑盒或試紙條，基本檢測不到棉籽餅中的變性Bt蛋白，迫切需要能夠識別變性Bt蛋白的抗體以及方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原及其制備的抗體和應用。本專利技術提供了用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原，是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產物。所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:用蛋白變性劑處理含有Bt蛋白的溶液，得到含有變性Bt蛋白的溶液。所述變性劑可為β-巰基乙醇和/或SDS (十二烷基橫酸納)。所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:將含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后進行變性處理，得到含有變性Bt蛋白的溶液；所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的體積配比為1:(1-10);所述溶液丙由溶質和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質及其濃度如下:體積比為0.1-2%的β -巰基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL的SDS。所述變性處理可為在40-100°C水中水浴。所述變性處理可為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。所述變性處理可為在-20°C冰箱反復凍融3次以上。所述變性處理可為調pH至3以下或調pH至10以上。所述調PH至3以下具體是通過加入硫酸水溶液的形式實現的。所述硫酸水溶液具體可為IM硫酸水溶液。所述調pH至10以上具體是通過加入氫氧化鈉水溶液的形式實現的。所述氫氧化鈉水溶液具體可為IM氫氧化鈉水溶液。所述含有變性Bt蛋白的溶液的制備方法可如下:將含有Bt蛋白的溶液進行變性處理，得到含有變性Bt蛋白的溶液。所述變性處理可為在40-100°C沸水中水浴。所述變性處理可為在100°C沸水中水浴3-5分鐘。所述變性處理可為在-20°C冰箱反復凍融3次以上。所述變性處理可為調PH至3以下或調pH至10以上。所述調pH至3以下具體是通過加入硫酸水溶液的形式實現的。所述硫酸水溶液具體可為IM硫酸水溶液。所述調pH至10以上具體是通過加入氫氧化鈉水溶液的形式實現的。所述氫氧化鈉水溶液具體可為IM氫氧化鈉水溶液。所述Bt蛋白可以為蘇云金芽孢桿菌的伴孢晶體、原核表達的Bt蛋白、轉基因作物中提取純化的Bt蛋白或者商購的Bt蛋白。以上任一所述含有Bt蛋白的溶液具體可為蛋白濃度為0.1-lmg/mL的Bt蛋白溶液。可用ρΗ7.5、0.lmol/L的PB緩沖液調整蛋白濃度。所述Bt蛋白具體可采用如下方法制備:(I)將抗蟲棉種 子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲；(2)將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀；(3)溶解步驟(2)得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙；(4)將所述溶液乙進行免疫親和層析，收集與抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌產生的單克隆抗體。雜交瘤Bt2F9為穩定分泌抗轉基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗體的單克隆雜交瘤細胞株，已于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.5162。所述步驟(I)中，可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取所述可溶性總蛋白。所述步驟(I)中，所述溶液甲的制備方法具體如下:將所述抗蟲棉種子去殼并研磨成粉，然后用PH10.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取(提取溫度具體可為4°C，提取時間具體可為4小時；提取過程中可用磁力攪拌器攪拌，以增加提取效率)，離心(離心條件具體可為:40C UOOOOrpm離心20分鐘)后避開表層油脂取上部液體，即為所述溶液甲。所述步驟(2)中，所述“進行60%飽和度的硫酸銨沉淀”的實現方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸銨并使其達到60%飽和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的時間具體可為40分鐘。所述冰浴放置過程中可用磁力攪拌器攪拌。所述離心的參數具體可為:4°C、7000rpm離心20分鐘。所述步驟(3)中，可用去離子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液調pH至10.5。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。所述步驟(4)中，所述免疫親和層析的步驟可如下:①將所述溶液乙上樣于連接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體的免疫層析柱；②用清洗液清洗柱子，去除雜蛋白用洗脫液進行洗脫，收集過柱后洗脫液，即為含有目的蛋白的溶液。所述免疫親和層析的填充料可為CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具體可為pH2.5、0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述洗脫液具體可為含體積比為50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述免疫親和層析過程中，具體可采用4轉/分的上樣流速、清洗流速和洗脫流速。所述步驟②中具體可用2倍上樣體積的清洗液清洗柱子。所述步驟③中具體可用3倍體積的洗脫液進行洗脫。所述步驟③中具體可按Iml每管收集過柱后的洗脫液。所述方法中還可包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述方法中還可包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5然后進行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。 所述方法中還可包括 將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5，然后檢測其中是否含有Bt毒蛋白，最后將含有Bt毒蛋白的溶液進行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。所述“檢測其中是否含有Bt毒蛋白”的具體方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶標板；(幻在步驟(i)的酶標板中加入調pH至7.5后的過柱后洗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于制備識別變性Bt蛋白的抗體的免疫原，是將含有變性Bt蛋白的溶液和佐劑混合并乳化得到的產物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王保民，曹振，張亮，張威，張瑞，譚桂玉，南鐵貴，崔永亮，郭素琴，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：