一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法技術

本發明專利技術公開了一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法。本發明專利技術提供的從抗蟲棉種子中純化Bt?Cry1Ac蛋白的方法，包括如下步驟：（1）將抗蟲棉種子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲；（2）將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀；（3）溶解步驟（2）得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙；（4）將所述溶液乙進行免疫親和層析，收集與抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9?CGMCC?No.5162分泌產生的單克隆抗體。本發明專利技術具有以下優點：（1）簡化了純化流程，降低了純化成本；（2）縮短了純化時間，減少了目的蛋白損失。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物化學領域，具體涉及。
技術介紹
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)在形成芽孢的過程中會產生一種伴胞晶體，該晶體的主要成分是具有殺蟲活性的蛋白質，被稱為殺蟲晶體蛋白(ICP, Insecticidal Crystal Protein),又稱 Bt 毒蛋白。Bt毒蛋白可毒殺鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲，是目前世界上應用最為廣泛的生物殺蟲劑。雖然人畜并非Bt毒蛋白的天然靶向物種，但圍繞轉Bt基因作物是否對人畜和環境有害的爭論從未停止。目前研究所使用的Bt毒蛋白絕大多數來自于原核表達，由于外源基因在植物體內的表達產物可能存在復雜的翻譯后修飾過程，可能會導致蛋白質在性質和功能上發生變化，所以使用原核表達的Bt毒蛋白并不能完全真實地反映轉Bt基因作物的危害。Bt CrylAc蛋白為Bt毒蛋白中的一種，其氨基酸序列如序列表的序列I所示，基因序列如序列表的序列2所示。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。本專利技術提供的從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法，包括如下步驟:(I)將抗蟲棉種子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲；(2)將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀；(3)溶解步驟(2)得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙；(4)將所述溶液乙進行免疫親和層析，收集與抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌產生的單克隆抗體。雜交瘤Bt2F9為穩定分泌抗轉基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗體的單克隆雜交瘤細胞株，已于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.5162。所述步驟(I)中，可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取所述可溶性總蛋白。所述步驟(I)中，所述溶液甲的制備方法具體如下:將所述抗蟲棉種子去殼并研磨成粉，然后用PH10.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取(提取溫度具體可為4°C，提取時間具體可為4小時；提取過程中可用磁力攪拌器攪拌，以增加提取效率)，離心(離心條件具體可為:40C UOOOOrpm離心20分鐘)后避開表層油脂取上部液體，即為所述溶液甲。步驟(I)中:Bt毒蛋白是堿溶性蛋白，使用堿性溶液進行可溶性總蛋白的提取能提高Bt毒蛋白的提取效率； 可溶性總蛋白的提取過程中會使種子內部的蛋白水解酶釋放到溶液中，在4°C下進行可溶性總蛋白的提取，可以使蛋白酶的活性降低，提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性總蛋白的提取過程中使用磁力攪拌，可以混勻提取體系，防止局部蛋白濃度過高而降低蛋白質進入溶液中的速率。所述步驟(2)中，所述“進行60%飽和度的硫酸銨沉淀”的實現方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸銨并使其達到60%飽和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的時間具體可為40分鐘。所述冰浴放置過程中可用磁力攪拌器攪拌。所述離心的參數具體可為:4°C、7000rpm離心20分鐘。步驟(2)中:抗體對蛋白質抗原的識別依賴于蛋白質一定的空間構象,溫度較高容易使蛋白質的空間構象發生改變，從而導致不能被抗體識別，在冰浴中進行硫酸銨沉淀可以避免Bt毒蛋白的構象發生改變，減少操作造成的Bt毒蛋白損失；硫酸銨沉淀的過程中使用磁力攪拌，可以混勻沉淀體系，使硫酸銨濃度迅速均勻化。所述步驟(3)中，可用去離子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液調pH至10.5。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。步驟(3)中:使用去離子水和IM Tris水溶液溶解沉淀，去離子水中含有極微量離子，能減少鹽溶性雜蛋白的溶解，使用Tris是促使溶液迅速變為堿性，有利于Bt毒蛋白的溶解。所述步驟(4)中，所述免疫親和層析的步驟可如下:①將所述溶液乙上樣于連接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體的免疫層析柱；②用清洗液清洗柱子，去除雜蛋白用洗脫液進行洗脫，收集過柱后洗脫液，即為含有目的蛋白的溶液。所述免疫親和層析的填充料可為CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具體 可為pH2.5、0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述洗脫液具體可為含體積比為50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl緩沖液。所述免疫親和層析過程中，具體可采用4轉/分的上樣流速、清洗流速和洗脫流速。所述步驟②中具體可用2倍上樣體積的清洗液清洗柱子。所述步驟③中具體可用3倍體積的洗脫液進行洗脫。所述步驟③中具體可按Iml每管收集過柱后的洗脫液。步驟(4)中:免疫親和層析的原理是利用抗原與抗體特異性識別并結合的特性，使抗原吸附到結合有抗體的填料上，雜蛋白由于不能與抗體結合而隨液流流出親和層析柱，因而使目的蛋白與雜蛋白分離，再使用較為苛刻的條件破壞抗原抗體的結合力而使抗原從結合有抗體的填料上分離下來，從而達到純化目的蛋白的目的；較慢的上樣流速是為了使樣品中的Bt毒蛋白能充分吸附到免疫親和層析柱上，較慢的清洗流速是為了充分地破壞雜蛋白與抗體間的作用力，去除雜蛋白，較慢的洗脫流速是為了充分地破壞Bt毒蛋白與抗體間的作用力，使Bt毒蛋白從免疫親和層析柱上解吸附。所述方法中還可包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述方法中還可包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5然后進行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。低pH條件下,蛋白質的構象會發生改變,也更易降解,使用IM Tris水溶液中和過柱后洗脫液，可以減少Bt毒蛋白的在低pH條件下地降解，并有助于其保持并恢復正常的構象。PBS緩沖液中含有足夠的鹽離子，可以有效地幫助Bt毒蛋白在表面形成水化層，從而有利于Bt毒蛋白在溶液中的穩定。所述方法中還可包括將所述過柱后洗脫液用Tris水溶液調pH至7.5，然后檢測其中是否含有Bt毒蛋白，最 后將含有Bt毒蛋白的溶液進行透析的步驟。所述Tris水溶液具體可為IM Tris水溶液。所述透析具體在PBS緩沖液中進行。所述透析的條件具體可為:用PBS緩沖液4°C透析6小時(每兩個小時更換新的PBS緩沖液)。所述“檢測其中是否含有Bt毒蛋白”的具體方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶標板；(幻在步驟(i)的酶標板中加入調pH至7.5后的過柱后洗脫液，37°C溫育30min ；(iii)在步驟(ii)的酶標板中加入辣根過氧化物酶標記的抗Bt CrylAc蛋白單克隆抗體，37°C溫育30min ；(iv)向步驟(iii)的酶標板中加入底物緩沖液,室溫反應15min后終止反應；(V )在 492nm 下測定 OD 值；(vi)將對照棉花本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法，包括如下步驟：（1）將抗蟲棉種子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲；（2）將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀；（3）溶解步驟（2）得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙；（4）將所述溶液乙進行免疫親和層析，收集與抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC?No.5162分泌產生的單克隆抗體。

【技術特征摘要】
1.一種從抗蟲棉種子中純化Bt毒蛋白的方法，包括如下步驟: (1)將抗蟲棉種子去殼后進行可溶性總蛋白的提取，得到溶液甲； (2)將所述溶液甲進行60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心收集沉淀； (3)溶解步驟(2)得到的沉淀并進行透析，得到溶液乙； (4)將所述溶液乙進行免疫親和層析,收集與抗BtCrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體特異結合的蛋白組分，即為Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的單克隆抗體為是由雜交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌產生的單克隆抗體。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，采用pH10.5、0.0lM的CAPS緩沖液提取所述可溶性總蛋白。3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，用去離子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液調pH至10.5。4...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王保民，張亮，曹振，郭素琴，譚桂玉，南鐵貴，李召虎，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：