本發明專利技術涉及一種蛋白質激發子Hrip1在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應用。Hrip1基因在擬南芥中表達后能夠顯著提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力。轉基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強。本發明專利技術對5個T1代轉基因擬南芥株系進行分子檢測,證明Hrip1在轉基因擬南芥株系中能夠正常轉錄和表達。轉基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強,75mmol?L-1NaCl和50mmol?L-1甘露醇滲透脅迫2d,轉基因植株種子平均相對發芽率是32.1%和77.9%,分別是野生型的3.72倍和5.61倍;150mmol?L-1NaCl和50mmol?L-1甘露醇處理擬南芥幼苗7d后,轉基因植株平均相對根長是81.79%和93.25%,分別是野生型的1.53和1.34倍。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種蛋白質激發子的應用。
技術介紹
在自然環境中，作物生長發育往往受到干旱、高溫、低溫等逆境脅迫，影響正常發育而造成減產，提高植物抗逆性是降低逆境傷害的重要途徑之一。通過現代生物技術將外源基因導入植物體內，是培育抗逆新品種的有效途徑。目前已有許多基因導入植物提高抗逆性的研究報道，這些基因主要包括兩類，第一類是功能基因，這些基因可以通過合成相關物質來提高植物在逆境中的抗性，如滲透調節物質合成基因等。滲透調節物質的合成對于維持植物在滲透脅迫環境中的生存至關重要，將P5cS、BADH、SacB等基因轉入植物體后脯氨酸，甜菜堿和糖類等含量明顯增加，同時轉基因作物抗逆性也明顯增強；如將PvP5CSl導入擬南芥中，在NaCl和甘露醇滲透脅迫下，轉基因植株種子發芽率和幼苗根長均比野生型顯著增加[1]。另一類是調節基因，此類基因在逆境信號轉導中發揮作用，迅速傳遞信息使植物在逆境中做出反應來抵抗惡劣環境，如DREB類轉錄因子，MYB類轉錄因子，蛋白激酶類基因等[2]。Liu等將小麥TaPMPl基因導入煙草中，干旱脅迫后，轉基因植株的存活率相對野生型提高20%-60%[3]。蛋白激發子能夠激發植物防御信號反應，通過信號識別和信號轉導，調節植物體內一系列基因的表達，啟動植物防衛反應，激活植物的免疫系統，調節植物生長代謝系統，能夠提高植物抗病能力，促進植物生長[4_5]。蛋白激發子不但具有激發植物防衛反應的功能，而且蛋白激發子轉入植物后也能夠提高植物抗病性。Yang等將激發子蛋白激發子MgSMl轉化擬南芥提高對病原真菌和細菌的抗性[6]。專利技術人實驗室將PemGl基因轉入水稻提高對稻瘟病的抗性[7]。Hripl是專利技術人從極細鏈格孢菌(A.tenuissima)中分離到的一種蛋白激發子，前期研究證明，Hripl蛋白滲入煙 草葉片后能夠引發煙草葉片的鈣離子流入、介質堿化、激活水楊酸途徑的蛋白激酶并且提高植物體內相關防衛基因的表達[8]。本專利技術將激活蛋白基因Hripl導入野生型擬南芥中，獲得了轉基因擬南芥植株，通過研究Hripl在抗逆過程中的作用，揭示蛋白激發子在生物脅迫適應性中的反應。
技術實現思路
本專利技術是申請號為:201110149203.3，申請日為:2011-06_03，專利技術名稱為:“提高植物抗性和誘導植物防御反應的蛋白質及其基因、應用”的中國專利技術專利申請的系列申請，所述專利申請已于2011-11-16公開，公開號102241752A;所述專利申請的說明書和權利要求書全文為本專利技術所引用。在上述專利申請中，專利技術人公開了一種能夠提高植物抗性及誘導植物防御反應的來自于極細鏈格孢菌(Alternaria tenuissima) JH505菌株的蛋白質及編碼該蛋白質的核苷酸序列，其中的蛋白質是一種蛋白質激發子，命名為Hripl (過敏反應誘導蛋白1，Hypersensitive response inducing proteinl)(其氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所不)；其編碼基因為Hripl基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示)。此專利申請重點研究了 Hripl基因可以誘導植物如煙草的抗性防御反應，如對煙草花葉病毒的抗性能力。本專利技術是在上述申請的基礎上，繼續研究了 Hripl基因在擬南芥中表達后能夠顯著提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力。轉基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強。本專利技術對5個T1代轉基因擬南芥株系進行分子檢測，證明Hripl在轉基因擬南芥株系中能夠正常轉錄和表達。轉基因植株對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強，75mmol T1NaCl和50mmol Γ1甘露醇滲透脅迫2d，轉基因植株種子平均相對發芽率是32.1%和77.9%,分別是野生型的3.72倍和5.61倍；150mmol T1NaCl和50mmol Γ1甘露醇處理擬南芥幼苗7d后，轉基因植株平均相對根長是81.79%和93.25%,分別是野生型的1.53和1.34倍。三周齡的轉基因植株在250mmol T1NaCl脅迫20d，平均存活率為67%，顯著高于野生型(42%) (P〈0.05);干旱脅迫25d后，復水5d轉基因植株平均存活率為72%，而野生型僅為44%。檢測結果顯示轉基因植株葉片的抗氧化酶活性明顯高于野生型，用200mmol T1NaCl和200mmol L—1甘露醇處理后24h，POD活性分別比野生型植株提高1.56和1.85倍，CAT活性分別比野生型植株提高1.64和1.86倍。以上結果說明，Hripl在擬南芥中的表達具有提高植株耐鹽抗旱能力的功能。附圖說明圖1:植物表達載體 pCAMBIA1301-CaMV35S-Hripl-Nos 的結構圖；圖2:轉 Hripl 基因植株的 PCR(A)、RT-PCR(B)和 Western Blotting(C)分析；圖3:NaCl和甘露醇脅迫下轉Hripl擬南芥種子和野生型種子發芽試驗；圖4:250mmol PNaCl脅迫處理轉基因擬南芥幼苗的生長狀況；圖5 =NaCl和甘露醇脅迫下轉Hripl擬南芥和野生型擬南芥植株葉片POD酶活含量，其中標以不同小寫字母者在p〈0.05水平上差異顯著；圖6 =NaCl和甘露醇脅迫下轉Hripl擬南芥和野生型擬南芥植株葉片CAT酶活含量，其中標以不同小寫字母者在p〈0.05水平上差異顯著。具體實施例方式為進一步說明本專利技術，結合以下實施例具體說明:I材料與方法1.1試驗材料哥倫比亞生態型(Col-O)野生型擬南芥和農桿菌菌株GV3101由專利技術人實驗室保存，已知。植物表達載體PCAMBIA1301。蛋白激發子Hripl抗體由華大基因制備。1.2表達載體構建以引物 5' -CATGCCATGGGCATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3 '(如 SEQ ID NO:3所示)和 5' -GGGTCACCTCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3 '(如 SEQ ID N0:4 所示)，以保存的Hripl基因為模板擴增蛋白激發子Hripl基因的完整開放閱讀框(open readingframe, 0RF)序列。選pCAMBIA1301載體序列上的Nco I和BstE II兩個酶切位點，將該表達載體的⑶S基因替換為Hripl基因，構建35S::Hripl植物雙元表達載體(圖1)。1.3轉Hripl基因擬南芥株系的獲得及篩選采用花序浸染法獲得轉Hripl基因擬南芥植株[9]。將Ttl代種子表面消毒后均勻鋪灑在含有25ug ml/1潮霉素的1/2MS培養基上，4°C均一化處理3d后，置于22°C光照(光周期為16h光照/8h黑暗)生物培養箱中進行培養。選取培養10-15d生長較快的綠苗移栽到培養土中繼續生長以收獲種子，篩選三代直到得到純合的轉基因株系。1.4轉基因擬南芥的分子鑒定分別提取轉Hripl擬南芥單株的DNA和RNA，以DNA和cDNA為模板，用引物 5 ' -ATGTACTTCTCGAATATACTCCCGG-3 '(如 SEQ ID NO:5 所示)和5' -TCAGCACTGAGGCAAGTTACAGACC-3'(如 SEQ ID NO:6 所示)進行 PCR 擴增，分別以野生型擬南芥(WT)和HriplPCR產本文檔來自技高網...
【技術保護點】
蛋白質激發子Hrip1在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應用，所述蛋白質激發子Hrip1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技術特征摘要】
1.蛋白質激發子Hripl在提高和改善植物的耐鹽和抗旱能力中的應用，所述蛋白質激發子Hripl的氨...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邱德文，劉崢，楊秀芬，曾洪梅，郭立華，袁京京，彭學聰，
申請(專利權)人：中國農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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