改進(jìn)植物中的蛋白產(chǎn)生制造技術(shù)

提供了在植物或植物部分內(nèi)合成目的蛋白的方法。所述方法包括處理植物以增加次生葉生物質(zhì)產(chǎn)生，隨后將編碼目的蛋白的與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)可操作地連接的一種或一種以上核酸序列引入植物中。然后將植物維持在允許編碼目的蛋白的核酸序列在植物或植物部分中表達(dá)的條件下。任選地，可以收獲植物或植物部分并提取目的蛋白。

Improving protein production in plants

Methods for synthesizing target proteins in plants or plant parts are provided. The method includes processing plants to increase secondary leaf biomass production, then encoding protein and activity in plants in the control region is operably connected to one or more nucleic acid sequences introduced in plants. The plant is then maintained under the condition that nucleic acid sequences that permit the encoding of the target proteins are expressed in plants or parts of the plant. Optionally, a plant or plant part can be harvested and the target protein is extracted.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】改進(jìn)植物中的蛋白產(chǎn)生專利
本專利技術(shù)涉及在植物中產(chǎn)生蛋白的方法。本專利技術(shù)還提供了增加植物中一種或多種蛋白產(chǎn)生的方法。專利技術(shù)背景基于植物的蛋白表達(dá)平臺(tái)是應(yīng)對(duì)全世界生物治療學(xué)和診斷學(xué)增長(zhǎng)需求的有用解決方案。與細(xì)菌或酵母不同，植物細(xì)胞能夠正確折疊、組裝并修飾哺乳動(dòng)物來(lái)源的復(fù)雜蛋白，如治療或診斷用抗體。與基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)相比，植物還在安全性、資本投資和容易放大方面呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)。因此，植物是用于產(chǎn)生當(dāng)前應(yīng)用于生命科學(xué)中的蛋白(諸如，例如mAbs或病毒抗原，如來(lái)自流感的HA)的合適宿主。WO07016276公開(kāi)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的方法，其通過(guò)在兩片子葉接觸的點(diǎn)切開(kāi)幼苗以去除兩片子葉和最初的真葉，并且允許從切割面長(zhǎng)出新枝。該方法包括使植物受傷，以利于在受傷部位引入農(nóng)桿菌并提高轉(zhuǎn)化效率。將切除的幼苗在細(xì)菌懸液中渦旋，所述懸液中包含攜帶期望的轉(zhuǎn)移DNA的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。受傷的步驟是轉(zhuǎn)化步驟之前所必須的。精確的切割介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化能夠?qū)е路€(wěn)定轉(zhuǎn)化從幼苗的切割面出現(xiàn)的新枝。這些枝能夠發(fā)育成植物的地上部分，并由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的子代。Spokevicus等(FunctionalPlantBiology2006)公開(kāi)了楊屬樹(shù)木中休眠側(cè)芽(DLB)的體內(nèi)轉(zhuǎn)化。通過(guò)中央垂直切割使DLB受傷，或者去除植物的頂部，并將剩下的DLB通過(guò)垂直切割、添加保護(hù)層或添加根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)相結(jié)合來(lái)處理。利用這種方法，受傷的步驟是轉(zhuǎn)化步驟之前所必須的。WO2008/151444公開(kāi)了利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在植物內(nèi)合成目的蛋白的方法。在期望的核酸構(gòu)建體浸潤(rùn)之前，植物被修剪。在用轉(zhuǎn)化有合適的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株真空浸潤(rùn)葉之前，通過(guò)擠壓機(jī)械從植物去除或化學(xué)修剪本氏煙(N.benthamiana)植株的頂芽和腋芽。Wydro等(ActaBiochimicaPolonica，Vol53No.2/2006289-298)公開(kāi)了在用根瘤農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本氏煙的最新的葉(位于植株的頂部)中檢測(cè)到了最高水平的瞬時(shí)綠色熒光蛋白(GFP)基因表達(dá)，而在位于中間和底部位置處的較老的葉中的表達(dá)則較低。Halfhill等(PlantCellRep22:338-343，2003)提出，GFP熒光的變化與葉老化過(guò)程中可溶性蛋白濃度的改變相關(guān)。在不同位置處的單片葉中，gfp基因表達(dá)的水平和可溶性蛋白的濃度在相似的時(shí)間并以相似的程度下降。Wydro等提出這兩個(gè)因素之間的密切關(guān)聯(lián)暗示GFP表達(dá)的下降是葉生理機(jī)能綜合變化的結(jié)果。通過(guò)開(kāi)發(fā)利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)瞬時(shí)蛋白表達(dá)的高產(chǎn)系統(tǒng)已增強(qiáng)了在植物中表達(dá)臨床上有用的蛋白。存在在植物中優(yōu)化表達(dá)并增加重組蛋白的數(shù)量和質(zhì)量的需求。專利技術(shù)概述本專利技術(shù)涉及在植物中產(chǎn)生蛋白的方法。本專利技術(shù)還提供了增加植物中一種或多種蛋白產(chǎn)生的方法。本專利技術(shù)的目的是提供在植物中產(chǎn)生蛋白的改進(jìn)方法。本專利技術(shù)提供了在植物或植物部分內(nèi)產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括：a)處理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生葉生物質(zhì)產(chǎn)生；b)將一種或一種以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含編碼所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)可操作地連接；c)在允許編碼所述目的蛋白的核苷酸序列表達(dá)的條件下培育所述植物或植物部分，由此產(chǎn)生所述目的蛋白，其中與在相同條件下生長(zhǎng)但未經(jīng)處理以增加次生葉生物質(zhì)的相似植物的相同植物組織獲得的目的蛋白的產(chǎn)量相比，所述目的蛋白的產(chǎn)量增加。可用于上述方法中的目的蛋白可以為抗體、抗原、疫苗或酶。目的蛋白可以為流感HA蛋白，并且在植物或植物部分中表達(dá)時(shí)，HA可以形成流感病毒樣顆粒(VLP)。一種或一種以上核酸可以被引入植物或植物部分中，所述植物或植物部分的次生葉生物質(zhì)與初生葉生物質(zhì)之比為0.2:1至3:1。本專利技術(shù)還提供了如上所述的方法，其中從引入一種或一種以上核酸的步驟之前約40天直到引入一種或一種以上核酸的當(dāng)天，或者從引入一種或一種以上核酸的步驟之前約40天直到收獲植物或植物部分的當(dāng)天實(shí)施步驟a)的處理步驟。本專利技術(shù)包括如上所述的方法，其中步驟a)的處理植物的步驟，包括：增加植物生長(zhǎng)過(guò)程中的光持續(xù)時(shí)間，增加植物生長(zhǎng)過(guò)程中的光強(qiáng)度，選擇生長(zhǎng)過(guò)程中植物所暴露的波長(zhǎng)，修剪植物初生莖的頂芽，在存在增加次生枝發(fā)育的試劑、激素或其組合的情況下培育植物，施加減弱頂端優(yōu)勢(shì)的化合物，機(jī)械修剪，化學(xué)修剪，基因修飾敲入、敲除，以及促進(jìn)次生生長(zhǎng)的植物育種，或以上的組合。在如上所述的方法中，可以在存在植物激素的情況下培育植物。例如，可以在存在約50ppm至900ppm植物激素的情況下培育植物。植物激素可以是合成的細(xì)胞分裂素，例如6-芐氨基嘌呤(BAP)。本專利技術(shù)還包括如上所述的方法，其中所述方法還包括收獲植物以及任選地純化目的蛋白的步驟。在收獲步驟中，可以收獲次生葉，或者初生葉和次生葉。此外，可以收獲次生葉、來(lái)自初生莖的中間葉(P2)和來(lái)自初生莖的新葉(P1)，或者可以收獲來(lái)自初生莖的中間葉(P2)、來(lái)自初生莖的新葉(P1)、來(lái)自次生莖的老葉(S3)、來(lái)自次生莖的中間葉(S2)和來(lái)自次生莖的新葉(S1)。此外，可以不收獲來(lái)自植物初生莖的老葉(P3)。本專利技術(shù)提供了如上所述的方法，其中在步驟b)的引入步驟中，核酸在植物中瞬時(shí)表達(dá)或者核酸在植物中穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)增加次生葉生物質(zhì)，與未經(jīng)處理以增加次生生物質(zhì)并在相同條件下生長(zhǎng)的植物的相同植物組織獲得的目的蛋白的產(chǎn)量相比，可以獲得來(lái)自初生生物質(zhì)和次生生物質(zhì)的蛋白產(chǎn)量的增加。本專利技術(shù)的概述未必描述了本專利技術(shù)的所有特征。附圖說(shuō)明從以下參照附圖的描述中，本專利技術(shù)的這些和其它特征將變得更加顯而易見(jiàn)，其中：圖1顯示了在溫室中不同的光周期(16h和24h)和光強(qiáng)度處理(80和160μmol/m2.s)下，浸潤(rùn)之前在生長(zhǎng)的植物的生物質(zhì)產(chǎn)生。收獲主莖的新葉(P1)、成熟葉(P2)和老葉(P3)以及次生莖的新葉(S1)、成熟葉(S2)和老葉(S3)，并測(cè)定生物質(zhì)。圖2顯示了在不同的光周期(16h和24h)和光強(qiáng)度處理(80和160μmol/m2.s)下，主莖的新葉(P1)、成熟葉(P2)和老葉(P3)以及次生莖的新葉(S1)、成熟葉(S2)和老葉(S3)中的HA產(chǎn)生。圖3顯示了在不同的光周期(16h和24h)和光強(qiáng)度處理(80和160μmol/m2.s)下，主莖的新葉(P1)、成熟葉(P2)和老葉(P3)以及次生莖的新葉(S1)、成熟葉(S2)和老葉(S3)中的HA總產(chǎn)量(HA/植株)。圖4顯示了在不同的光周期(16h和24h)和光強(qiáng)度處理(80和160μmol/m2.s)下，主莖的葉(底部(P))和次生莖的葉(頂部(S))中的HA總產(chǎn)量。圖5顯示了在生長(zhǎng)室中低光強(qiáng)度或高光強(qiáng)度下生長(zhǎng)的植物的生物質(zhì)產(chǎn)生。收獲主莖的新葉(P1)、成熟葉(P2)和老葉(P3)以及次生莖的新葉(S1)、成熟葉(S2)和老葉(S3)，并測(cè)定生物質(zhì)。圖6顯示了在生長(zhǎng)室中低光強(qiáng)度或高光強(qiáng)度下生長(zhǎng)的每株植物的HA總產(chǎn)量。收獲主莖的新葉(P1)、成熟葉(P2)和老葉(P3)以及次生莖的新葉(S1)、成熟葉(S2)和老葉(S3)，并測(cè)定每株植物的HA總產(chǎn)量。圖7顯示了具有初生葉(P1、P2、P3)和次生葉(SI1、S2、S3)的植物的示意圖。圖8顯示了修剪(在這種情況下，在幼苗移植后5、7或12天從本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
在植物或植物部分內(nèi)產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括：a)處理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生葉生物質(zhì)產(chǎn)生；b)將一種或一種以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含編碼所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)可操作地連接；c)在允許編碼所述目的蛋白的核苷酸序列表達(dá)的條件下，培育所述植物或植物部分，由此產(chǎn)生所述目的蛋白，其中與在相同條件下生長(zhǎng)但未經(jīng)處理以增加次生生物質(zhì)的相似植物的相同植物組織獲得的目的蛋白的產(chǎn)量相比，所述目的蛋白的產(chǎn)量增加。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2014.07.11 US 62/023,7181.在植物或植物部分內(nèi)產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括：a)處理所述植物或植物部分以增加所述植物或植物部分中的次生葉生物質(zhì)產(chǎn)生；b)將一種或一種以上核酸引入所述植物或植物部分，所述核酸包含編碼所述目的蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)可操作地連接；c)在允許編碼所述目的蛋白的核苷酸序列表達(dá)的條件下，培育所述植物或植物部分，由此產(chǎn)生所述目的蛋白，其中與在相同條件下生長(zhǎng)但未經(jīng)處理以增加次生生物質(zhì)的相似植物的相同植物組織獲得的目的蛋白的產(chǎn)量相比，所述目的蛋白的產(chǎn)量增加。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟a)的處理步驟中，所述植物或植物部分的次生葉生物質(zhì)與初生葉生物質(zhì)之比為0.2:1至3:1。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中從引入一種或一種以上核酸的步驟之前約40天直到且包括引入所述一種或一種以上核酸的當(dāng)天，或者從引入一種或一種以上核酸的步驟之前約40天直到且包括收獲所述植物或植物部分的當(dāng)天，實(shí)施步驟a)的處理植物的步驟。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟a)的處理植物的步驟，包括增加植物生長(zhǎng)過(guò)程中的光持續(xù)時(shí)間，增加植物生長(zhǎng)過(guò)程中的光強(qiáng)度，修剪植物的頂芽，在存在增加次生莖形成的試劑、激素或其組合的情況下培育植物，施加減弱頂端優(yōu)勢(shì)的化合物，或者以上的組合。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述修剪包括機(jī)械修剪或化學(xué)修剪。6.如權(quán)利要求1所述的方...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：多米尼克·米考德，斯蒂夫·珀皮恩，吉爾伯特·艾西爾，瑪麗克萊爾·古利特，琳達(dá)·高德瑞奧，瑪耶勒·加涅，米歇爾·馬特爾，尼克爾·貝克托爾德，馬克安德烈·道斯特，安德烈·戈瑟蘭，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：莫迪卡戈公司，拉瓦勒大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：加拿大,CA