黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR14及其編碼基因和應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR14及其編碼基因及應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)獲得MfcpCOR14基因，并將獲得的MfcpCOR14基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織，然后培育成轉(zhuǎn)基因植株。MfcpCOR14基因受低溫的誘導(dǎo)；本發(fā)明專利技術(shù)提供了利用MfcpCOR14基因培育耐寒、耐強(qiáng)光植物的方法，將該基因在植物過(guò)量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)優(yōu)于野生型植株，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株明顯提高了抗寒性和抗強(qiáng)光能力。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH及其編碼基因和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量會(huì)受各種不利的環(huán)境條件嚴(yán)重影響，熱帶植物特別容易受到低溫的傷害。培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。然而，植物耐逆性是一個(gè)數(shù)量性狀，涉及至少幾百個(gè)基因的作用，因此從耐逆性強(qiáng)的植物中分離耐性基因是十分必要的。黃花苜猜(Medicago sativa subsp.falcata)是一種非常耐寒的豆科牧草種質(zhì)，在寒冷的西伯利亞也有分布，從中克隆抗寒基因，能為轉(zhuǎn)基因育種提供更為優(yōu)良的目的基因，而且對(duì)于農(nóng)林植物抗逆分子育種尤為重要和迫切。黃花苜蓿在冷馴化中mRNA和蛋白發(fā)生變化(Chinnusamy et al.2007),除了對(duì)少數(shù)幾個(gè)冷馴化特異基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析夕卜(Mohapatra et al.1989, Wolfraim et al.1993),利用黃花苜猜分離抗寒基因的研究很少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本專利技術(shù)的首要目的是提供一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14。 本專利技術(shù)的另一目的在于提供編碼所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的基因。本專利技術(shù)的再一目的在于提供所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14,其氨基酸序列如下所示:MATMLTSNTLFQTSNSFPNVPSLTLPKPSRVFLASNWRNASEGTKNTSLSWAYTSSSTKTRRYADGTAGKAGETVNAGIDDIKQFGQDADEKTKDAASSIADKAKENTDKTVEAVGSAGDKAKDYAFDANDKAKEAIGSATDKAKEGFEAATKNTQEAAGSATEALKNA⑶QAKEAVEGALDAAKDAVAGKE ；編碼所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的核苷酸序列如下所示:ATGGCAACAATGTTGACAAGTAACACACTCTTCCAAACCTCAAACTCATTCCCTAATGTCCCTTCACTCACCCTTCCTAAACCCTCCAGGGTCTTCTTAGCTTCCAACTGGAGAAATGCATCAGAAGGAACAAAAAACACTTCACTCAGTTGGGCTTACACTTCTTCTTCTACAAAGACAAGAAGATATGCAGATGGAACAGCCGGCAAAGCCGGAGAAACGGTGAACGCAGGCATAGATGACATCAAACAATTCGGACAAGATGCAGATGAAAAGACAAAGGACGCTGCGAGTTCAATTGCGGATAAAGCAAAAGAAAACACAGACAAGACTGTAGAGGCAGTAGGAAGTGCTGGAGACAAGGCAAAAGATTATGCTTTTGATGCAAATGACAAAGCCAAGGAAGCAATAGGTTCTGCTACTGATAAGGCAAAAGAAGGATTTGAGGCAGCAACGAAGAACACACAGGAGGCTGCTGGGTCAGCGACAGAGGCTCTGAAGAATGCAGGAGATCAGGCAAAGGAGGCGGTGGAAGGAGCGTTGGACGCGGCCAAGGATGCCGTGGCTGGGAAGGAGTAA ；上述黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH在促進(jìn)植物生長(zhǎng)及提高植物抗寒性和抗強(qiáng)光能力中的應(yīng)用:該應(yīng)用包括用本專利技術(shù)的MfcpCORH基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成轉(zhuǎn)基因植株。所述的用本專利技術(shù)的MfcpCORH基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體；所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉基因槍轉(zhuǎn)化的載體；所述的雙元農(nóng)桿菌載體包括pBI121，pCAMBIA系列載體；所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段；使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子和泛素(Ubiqutin)啟動(dòng)子，它可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外使用本專利技術(shù)的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域包括但不限于ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以使多種不同的來(lái)源，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或來(lái)自結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，包括加入或替換植物可選擇性標(biāo)記。可使用的選擇性標(biāo)記包括編碼抗除草劑的酶的基因或具有抗性的抗生素標(biāo)記物；所述的除草劑包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有MfcpCORH基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。本專利技術(shù)的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化，顯微注射、電穿孔等各種常規(guī)或特異的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是雙子葉植物或單子葉植物。所述的MfcpCORH基因片段的獲得和植物表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟:(I)引物設(shè)計(jì)①M(fèi)fcpCORH 擴(kuò)增上游引物 RT81:CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA ；②MfcpCORH 擴(kuò)增下游引物 RT82:CTTACTCCTTCCCAGCCACG ；③弓丨入BamH I 酶切位點(diǎn)的上游引物 pMDl:GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCATATGG ；④突變?cè)蠦amH I酶切位點(diǎn)，引入Xba I酶切位點(diǎn)的下游引物pMD2:GTGATCTAGAGCTCGGTACCCGGAAATCCGA ；(2) MfcpCORH基因片段的獲得:以黃花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA為模板，使用引物①和引物②擴(kuò)增MfcpCORH基因片段，并連接進(jìn)入pMD20-T載體中，構(gòu)建獲得pMD_MfcpC0R14載體； (3)植物表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14的構(gòu)建以pMD20-MfcpC0R14載體為模板，使用引物③和引物④使MfcpCORH基因片段引Λ Xba I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14 ；所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因煙草；所述的轉(zhuǎn)基因煙草的獲得，包括以下的步驟:(I)用電轉(zhuǎn)的方法將pBI_MfcpC0R14導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落；(2)將活化的含有表達(dá)載體pB1-MfcpC0R14的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草無(wú)菌苗葉盤(pán)，經(jīng)共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。專利技術(shù)人從黃花苜蓿中克隆了一個(gè)新基因的cDNA序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查不到與它同源性高的蛋白序列；該基因表達(dá)受低本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。2.編碼權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。3.權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭振飛，卓春柳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：