新蘇云金芽孢桿菌晶體多肽、多核苷酸及其組合物制造技術

本發明專利技術提供了涉及改組的蘇云金芽孢桿菌Cry1多肽的殺昆蟲多肽。還提供了編碼本發明專利技術的多肽的核酸。包含了關于使用本發明專利技術的多肽和核酸增強植物對于昆蟲捕食的抗性的方法。

【技術實現步驟摘要】
總的來說，本專利技術涉及害蟲控制領域，并且提供了與蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)Cryl多肽相關的殺昆蟲(insecticidal)多肽和編碼其的多核苷酸。本專利技術還涉及用于改變植物對昆蟲捕食的抗性的方法和組合物，包括但不限于轉基因植物生產。
技術介紹
眾多有商業價值的植物，包括常見的農業作物，易受昆蟲和線蟲害蟲的攻擊。這些害蟲可以引起農作物產量和品質中的相當大減少。一般地，農民已在很大程度上依賴于化學殺蟲劑以對抗害蟲損害。然而，化學殺蟲劑的使用引起其自己的一套問題，包括應用殺蟲劑的成本和不便。此外，化學殘余物引起環境和健康關注。為了這些和其他原因，存在關于可替代的殺昆蟲劑的需要?？刂坪οx的環境友好的方法是使用衍生自土壤細菌蘇云金芽孢桿菌(“Bt”)的殺蟲晶體蛋白質，通常稱為“Cry蛋白質”。Cry蛋白質是在蘇云金芽孢桿菌的孢子形成后期過程中以結晶形式作為毒素原積聚的球狀蛋白質分子。由害蟲攝入后，晶體在幼蟲的堿性中腸環境中溶解以釋放毒素原。毒素原( 130kDa)由腸蛋白酶轉變為成熟的毒性片段( 66kDa N末端區域)。這些蛋白質中的許多對于特定靶昆蟲是相當毒性的，但對于植物和其他非靶生物是無害的。一些Cry蛋白質已在農作物植物中重組表達，以提供抗蟲性轉基因植物。在這些中，Bt-轉基因棉花和玉米已進行廣泛栽培。許多Cry蛋白質已得到分離、表征且基于氨基酸序列同源性進行分類(Crickmore等人，1998，Microbiol. Mol. Biol. Rev. ,62 :807-813)。這個分類方案提供了用于命名且分類新近發現的Cry蛋白質的系統機制。Cryl分類法是最為人所知的，并且包含目前總數超過130個的最高數目的cry基因。一般已發現個別Cry蛋白質具有相對窄的活性譜。例如，CrylAc是在轉基因棉花中用于控制煙芽夜蛾(H. virescens)和谷實夜蛾(H. zea)昆蟲害蟲中采用的第一種毒素。這種毒素因其針對煙芽夜蛾的高水平毒性而已知。然而，它在其控制谷實夜蛾的能力方面略微不足，并且對于灰翅夜蛾屬(Spodoptera)物種幾乎沒有活性。此外，CrylAb毒素對于谷實夜蛾具有比CrylAc略微更少的活性，但 針對甜菜夜蛾(S. exigua)具有優良得多的活性。第二代轉基因農作物可以對昆蟲更有抗性，如果它們能夠表達多重和/或新Bt基因的話。因此，具有寬活性譜的新殺昆蟲蛋白質將是高度需要的。
技術實現思路
本專利技術涉及衍生自蘇云金芽孢桿菌Cryl多肽(例如CrylAa、CryIAb> CryIAc>CrylAcUCrylAe、CrylAg 和 CrylCa)的 Cry 多肽，包括但不限于，SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28的Cryl衍生多肽。除了 Cryl衍生多肽的多肽序列之外，應當認識到本專利技術的多肽還包含其變體，包括但不限于，任何片段包括腸激活的成熟毒素片段、類似物、同源物、天然存在的等位基因、或其突變體。本專利技術的多肽還包含由本專利技術的任何Cryl衍生核酸編碼的那些多肽。在一個實施方案中，改組多肽具有至少一種Cryl功能活性(例如殺昆蟲活性)，并且與 SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中任何一種或其變體的多肽序列的成熟毒素部分至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99. 5%等同。在另一個實施方案中，多肽具有至少一種Cryl功能活性(例如殺昆蟲活性)，并且與 SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中任何一種或其變體的多肽序列的成熟毒素部分至少99% or 99. 5%等同。還提供了例如通過重組方法生產本專利技術多肽的方法。還包括了包含本專利技術的一種或多種多肽的組合物。本專利技術還涉及SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25 和 27 的 Cryl衍生的核酸分子。本專利技術還包含了編碼多肽的片段和類似物，所述多肽是至少部分功能活性的，即，它們能夠顯示與野生型Cryl多肽相關的一種或多種已知的功能活性。在一個實施方案中，它包含與 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27 中的任何一種或其互補體(compliment)至少至少 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 %或99. 5 %等同的分離的改組核酸分子。在另一個實施方案中，它包含分離的核酸分子，其與 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27 中的任何一種或其互補體的多肽序列的成熟毒素部分至少99%或99. 5%等同。還包括了包含本專利技術的核酸的載體。還包括了包含本專利技術載體的細胞或植物。本專利技術還涉及表達本專利技術的核酸和/或多肽的轉基因植物。轉基因植物可以以本領域已知的任何方式表達轉基因，包括但不限于組成型表達、發育調節的表達、組織特異性表達等。還包含了得自本專利技術的轉基因植物的種子。附圖說明圖I顯示了從CrylAb單基因改組分離的變體針對谷實夜蛾的殺昆蟲活性。將每種純化的毒素原引入昆蟲的飲食內，并且測定各自的EC5tlt5隨后將EC5tl值轉變成相對的倒數值。野生型CrylCa針對谷實夜蛾的EC5tl給出I. 0的值。剩余毒素原的EC5tl指定相對值。圖2顯示由改組的變體AR6編碼的毒素原與野生型CrylAb、CrylAc和CrylCa對煙芽夜蛾、谷實夜蛾和甜菜夜蛾的相對活性的比較。將每種純化的毒素原引入昆蟲的飲食內，并且測定各自的EC5tlt5隨后將EC5tl值轉變成相對的倒數值。對于每個昆蟲類型顯示最低EC5tl(最高比活性)的毒素原給出I. O的值。剩余毒素原的EC5tl指定較低的相對值。圖3顯示CrylCa改組的變體針對甜菜夜蛾的相對功效。將每種純化的毒素原引入昆蟲的飲食內，并且測定各自的EC5tlt5隨后將EC5tl值轉變成相對的倒數值。野生型CrylCa針對甜菜夜蛾的EC5tl給出I. 0的值。剩余毒素原的EC5tl指定相對值。圖 4 顯示合成 AR6(SEQ ID N0:5)、MR8' (SEQ ID NO :11 和 CR62 (SEQ ID ·NO :9)基因在瞬時葉測定中的表達。合成基因使用土壤桿菌屬(Agrobacterium)葉浸潤測定在本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉中進行表達。所產生的葉提取物的蛋白質印跡證實來自AR6、MR8'和CR62合成基因的毒素原的產生。泳道如下分子量標記、IOOng CrylCa毒素原標準、200ng CrylCa毒素原標準、來自表達合成MR8'的葉的提取物、來自表達合成AR6的葉的提取物、來自表達合成CR62的葉的提取物。針對純化的CrylCa蛋白質產生的兔多克隆抗血清用于探測蛋白質印跡(已預先確定CrylCa多克隆抗血清與AR6、CR62和MR8'蛋白質強交叉反應)。圖5A-5B顯示合成AR6、MR8'和CR62本文檔來自技高網...

【技術保護點】
多肽，其包含與SEQ?ID?NOS：8、10或12中的任一具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述的多肽具有殺昆蟲活性。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：D切爾夫，R聰，M弗里曼，K麥布賴德，山本敬司，
申請(專利權)人：先鋒高級育種國際公司，
類型：發明
國別省市：