本發明專利技術涉及一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，殺蟲蛋白質包括：（a）如SEQ?ID?NO:2或其第1-640位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或（b）在（a）中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由（a）衍生的蛋白質；或（c）通過包含SEQ?ID?NO:1的第1-1920位核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質；或（d）通過包含具有在嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1的第1-1920位核苷酸序列雜交的互補序列的核酸分子的表達產生的蛋白質；或（e）通過包含與（d）的核苷酸序列同類編碼的核酸分子的表達產生的蛋白質。本發明專利技術殺蟲蛋白質表達量高且對昆蟲害蟲的毒力強。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC9殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途。
技術介紹
植物蟲害是導致農作物損失的主要因素，給農民造成重大的經濟損失，甚至影響到當地人口的生存狀況。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制齊U，但二者在實際應用中都具有局限性化學殺蟲劑會帶來環境污染的問題，并導致抗藥性昆蟲的出現；而生物殺蟲制劑在環境中容易降解，在生產上需要重復施用，大大增加了生產成本。為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應用中的局限性，科學家們經過研究 發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。PIC9殺蟲蛋白是一種伴孢不溶性晶體蛋白。PIC9蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性PH環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾或棉鈴蟲等。目前未發現PIC9殺蟲蛋白在植物中的表達水平和毒力的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種殺蟲蛋白質、其編碼基因及用途，所述PIC9殺蟲蛋白在植物中(尤其為玉米)具有較高的表達量和毒力。為實現上述目的，本專利技術提供了一種殺蟲蛋白質，包括(a)如SEQ ID NO:2所示的第1-640位氨基酸序列組成的蛋白質；或(b)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或(c )在(a)或(b )中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質；或(d)通過包含SEQ ID NO: I的第1-1920位核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質；或(e)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ ID NO: I的第1-1920位核苷酸序列雜交的互補序列；或(f)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列與(e)的核苷酸序列同類編碼。所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實現上述目的，本專利技術提供了一種殺蟲基因，包括(a)編碼如SEQ ID NO:2所示的第1_640位氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列；或(b)編碼如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列；或(c)編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在(a)或(b)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質；或(d)具有SEQ ID NO: I的第1-1920位所示的核苷酸序列；或(e)在嚴格條件下與(d)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的 核苷酸序列；或(f)與(e)的核苷酸序列同類編碼。所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控下的所述殺蟲基因。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的重組載體。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述殺蟲基因的轉基因宿主生物，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種產生殺蟲蛋白質的方法，包括獲得所述轉基因宿主生物的細胞；在允許產生殺蟲蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞；回收所述殺蟲蛋白質。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括將所述表達盒在植物中與至少一種不同于所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質的第二種殺蟲蛋白質一起表達。進一步地，所述第二種殺蟲蛋白質為Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。在本專利技術中，PIC9殺蟲蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達PIC9殺蟲蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Vip類殺蟲蛋白質。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種產生抗蟲植物的方法，包括將所述殺蟲基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物。優選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，使導入后的植物產生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質。優選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種由包含所述殺蟲基因的核苷酸序列編碼的雜合殺蟲蛋白質。進一步地，所述雜合殺蟲蛋白質是由如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列編碼的。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括使昆蟲害蟲與抑制量的所述殺蟲蛋白質或由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質或所述雜合殺蟲蛋白質接觸。優選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本專利技術中為將·外源DNA導入植物細胞，常規轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。本專利技術中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。本專利技術中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質為昆蟲毒素。本專利技術中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規技術，優選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。保守取代的實例是在下列氨基酸組內發生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種殺蟲蛋白質，其特征在于，包括：（a）如SEQ？ID？NO:2所示的第1？640位氨基酸序列組成的蛋白質；或（b）如SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或（c）在（a）或（b）中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由（a）或（b）衍生的蛋白質；或（d）通過包含SEQ？ID？NO:1的第1？1920位核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質；或（e）通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ？ID？NO:1的第1？1920位核苷酸序列雜交的互補序列；或（f）通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產生的蛋白質，所述核苷酸序列與（e）的核苷酸序列同類編碼。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張愛紅，龐潔，牛瑞琪，牛麗紅，高超，苗猛猛，楊東海，
申請(專利權)人：北京大北農科技集團股份有限公司，北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心，
類型：發明
國別省市：
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