殺蟲基因及其用途制造技術

本發明專利技術涉及一種殺蟲基因及其用途，所述殺蟲基因的核苷酸序列包括：(a)具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或(b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ?ID?NO:2；或(c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列。本發明專利技術殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達，尤其是玉米和水稻，不僅顯著提高了PIC2-01殺蟲蛋白的表達量和穩定性，而且還顯著增強了PIC2-01殺蟲蛋白對昆蟲害蟲的毒力，尤其是鱗翅目昆蟲害蟲。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種殺蟲基因及其用途，特別是涉及一種改造的PIC2-01殺蟲基因及其用途。
技術介紹
植物蟲害是導致農作物損失的主要因素，給農民造成重大的經濟損失，甚至影響到當地人口的生存狀況。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制齊U，但二者在實際應用中都具有局限性:化學殺蟲劑會帶來環境污染的問題，并導致抗藥性昆蟲的出現；而生物殺蟲制劑在環境中容易降解，在生產上需要重復施用，大大增加了生產成本。為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應用中的局限性，科學家們經過研究發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。PIC2殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是不溶性伴孢結晶蛋白。PIC2蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。玉米和水稻是世界上分布廣泛的糧食作物，每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲、東方黏蟲或二化螟等。已證明PIC2蛋白可以抵擋多種鱗翅目昆蟲害蟲(如玉米螟、棉鈴蟲等)的侵害，且目前鮮有依據植物的偏好密碼子對PIC2殺蟲蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列進行改造的研究，尤其是針對單子葉植物(如玉米)以提高其在植物中的表達水平和效果。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種殺蟲基因及其用途，其是依據玉米的偏好密碼子而進行的優化改造，使得PIC2-01殺蟲蛋白在植物中(尤其為玉米和水稻)具有較高的表達量和毒力。為實現上述目的，本專利技術提供了一種殺蟲基因，其核苷酸序列包括:(a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ ID NO: 2 ;或(c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列。 所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控下的所述殺蟲基因。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的重組載體。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的轉基因宿主生物，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種產生殺蟲蛋白質的方法，包括:獲得所述轉基因宿主生物的細胞；在允許產生殺蟲蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞；回收所述殺蟲蛋白質。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括:將所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質在植物中與至少一種不同于所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質的第二種殺蟲核苷酸一起表達。進一步地，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。可選擇地所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。在本專利技術中，PIC2-01殺蟲蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達 可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達PIC2-01殺蟲蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉特定基因的表達。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種產生抗蟲植物的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物。優選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物，使導入后的植物產生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質。優選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本專利技術中為將外源DNA導入植物細胞，常規轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。為實現上述目的，本專利技術還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括:使昆蟲害蟲與抑制量的由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。優選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。本專利技術中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。本專利技術中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本專利技術的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調控序列控制下。本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本專利技術包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本專利技術還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。本專利技術中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本專利技術殺蟲基因雜交。任何常規的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本專利技術殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本專利技術中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本專利技術中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在至少常規的“低度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在常規的“高度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具 有“互補性”本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種殺蟲基因，其特征在于，其核苷酸序列包括：(a)具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或(b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ?ID?NO:2；或(c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種殺蟲基因，其特征在于，其核苷酸序列包括: (a)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQID NO: 2 ;或 (c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列。2.一種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調控序列調控下的權利要求1所述殺蟲基因。3.一種包含權利要求1所述殺蟲基因或權利要求2所述表達盒的重組載體。4.一種包含權利要求1所述殺蟲基因或權利要求2所述表達盒的轉基因宿主生物，其特征在于，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。5.根據權利要求4所述轉基因宿主生物，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。6.—種產生殺蟲蛋白質的方法，其特征在于，包括: 獲得權利要求4或5所述轉基因宿主生物的細胞； 在允許產生殺蟲蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞； 回收所述殺蟲蛋白質。7.一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，包括:將權利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質或權利要求2所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質在植物中與至少一種不同于權利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質或權利要求2所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質的第二種殺...

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁德榮，
申請(專利權)人：北京大北農科技集團股份有限公司，北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心，
類型：發明
國別省市：