本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種人Irisin重組蛋白的DNA序列。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種人Irisin重組蛋白。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。本發(fā)明專利技術(shù)還公開一種轉(zhuǎn)基因重組菌。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種人Irisin重組蛋白的制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所提供的方法步驟簡便，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)周期短，通過本發(fā)明專利技術(shù)所提供的方法，可得到純度較高的目的蛋白。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域中重組基因的真核表達(dá)和純化方法，特別涉及一種人重組Irisin蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)和純化方法。
技術(shù)介紹
Irisin是2012年年初在《自然》雜志上報道的一種新的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切III型纖連蛋白組件包含蛋白5(fibronectin type III domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5)后形成的可分泌多肽片段。人FNDC5的N-端有一個信號序列，中間為III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(FND)，緊接其后的為疏水氨基酸區(qū)和C-末端。Irisin是FNDC5中纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的主要部分，是由112個氨基酸殘基組成的N-糖基化蛋白質(zhì)激素，其序列在種屬間高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性為100％。發(fā)現(xiàn)者用希臘神話中信使女神Iris的名字為Irisin命名，暗喻其像Iris一樣，作為骨骼肌的使者，傳遞骨骼肌的信號，并連接骨骼肌與外周組織的關(guān)系。Irisin最重要的生物學(xué)功能是通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪細(xì)胞，使后者轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹纸獯x脂肪特征的棕色脂肪細(xì)胞，以產(chǎn)熱的方式消除白色脂肪，從而起到減肥作用。研究表明，Irisin水平主要反映了肌肉質(zhì)量，且在年輕的男性運(yùn)動員中其量高于老年女性；另有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且與新發(fā)II型糖尿病的發(fā)病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中發(fā)揮關(guān)鍵作用；此外，有關(guān)報道還指出Irisin與非酒精性脂肪肝、心率衰竭等病理現(xiàn)象存在一定的相關(guān)性。可以看出Irisin必將是一個很有前景的活性因子，并成為代謝性疾病及其并發(fā)癥防治的新靶點(diǎn)，有非常大的潛在價值。因此，開發(fā)Irisin蛋白的可大規(guī)模生產(chǎn)并便于純化的方法，具有非常大的價值。但是目前國內(nèi)外還沒有研究報道將該人重組Irisin蛋白用于畢赤酵母中的表達(dá)與純化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)目的：本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列。本專利技術(shù)的另一個目的在于提供一種人Irisin重組蛋白。本專利技術(shù)的又一個目的是提供含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。本專利技術(shù)的又一個目的是提供一種含有所述的人Irisin重組蛋白的轉(zhuǎn)基因重組菌。本專利技術(shù)的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的制備方法。本專利技術(shù)的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應(yīng)用。技術(shù)方案：為了解決上述問題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。一種人Irisin重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。將所述的DNA序列插入到畢赤酵母分泌表達(dá)載體中得到的表達(dá)人Irisin重組蛋白的DNA的重組表達(dá)載體。其中，上述畢赤酵母分泌表達(dá)載體為pPIC9K。一種轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中，篩選得到轉(zhuǎn)基因重組菌(轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株)。其中，上述畢赤酵母為GS115(購自ivitrogen公司)。其中，上述的DNA序列、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在生產(chǎn)人Irisin重組蛋白中的應(yīng)用。一種人Irisin重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：1)從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉(zhuǎn)錄PCR得到其cDNA，以cDNA為模板，PCR得到人Irisin的基因片段，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示；2)經(jīng)過PCR將His標(biāo)簽插入人Irisin的基因片段，得到人Irisin-his片段；3)構(gòu)建pPIC9K-Irisin-his重組表達(dá)載體：將人Irisin-his片段插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-Irisin-his；4)構(gòu)建GS115-pPIC9K-Irisin-his重組酵母菌株：重組表達(dá)載體pPIC9K-Irisin-his電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，并通過組氨酸缺陷篩選和G418篩選得到轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株GS115-pPIC9K-Irisin-his；5)人Irisin重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定：通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)和鎳柱純化得到人Irisin重組蛋白，并通過細(xì)胞活性試驗(yàn)鑒定其活性。上述的人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應(yīng)用。有益效果：本專利技術(shù)相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：本專利技術(shù)所提供的人Irisin重組蛋白的制備方法具有方法易行，操作簡便，表達(dá)量高，成本低廉，通過本專利技術(shù)所提供的方法，可得到具有生物學(xué)活性的人Irisin重組蛋白，可用于代謝性疾病藥物的制備。其最主要優(yōu)勢在于：本專利技術(shù)首次以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)人Irisin重組蛋白的分泌表達(dá)，并通過鎳柱純化，可得到了經(jīng)過糖基化修飾且具有生物學(xué)活性的人Irisin重組蛋白。附圖說明圖1：pPIC9K-Irisin-his重組載體酶切檢驗(yàn)瓊脂糖電泳分析圖(第1泳道M為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；第2泳道1為經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切的pPIC9K-Irisin-his重組載體；第3泳道2為未經(jīng)酶切的pPIC9K-Irisin-his重組載體；經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生一條Irisin-his條帶和一條大于5000bp的質(zhì)粒條帶，表明Irisin-his序列已成功插入表達(dá)載體；)圖2：GS115-pPIC9K-Irisin-his重組菌株表型鑒定圖(篩選得到的轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株在MD和MM平板上都能正常生長，證明本專利技術(shù)所得菌株表型為Mut+)；圖3：GS115-pPIC9K-Irisin-his重組菌株表型PCR法鑒定瓊脂糖電泳分析圖(第1泳道M為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；第2泳道1模板為GS115基因組；第3泳道2模板為pPIC9K-Irisin-his重組載體；第4～8泳道3-7模板為GS115-pPIC9K-Irisin-his不同菌株基因組；以GS115基因組為模板只擴(kuò)增出一條約2200bp的野生AOX1基因片段，以pPIC9K-Irisin-his重組質(zhì)粒為模板只擴(kuò)增出一條約含有目的基因的約800bp的片段，而以GS115-pPIC9K-Irisin-his重組菌株的基因組為模板擴(kuò)展出了2200bp和800bp兩個片段，說明其表型為Mut+；)圖4：GS115-pPIC9K-Irisin-his基因組PCR檢驗(yàn)瓊脂糖電泳分析圖(第1泳道M為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；第2～6泳道1-5為以不同轉(zhuǎn)化子基因組做模板PCR產(chǎn)物；第7泳道6為陰性對照；提取重組菌株基因組做PCR能得到與人Irisin-his大小相符的條帶，說明pPIC9K-Irisin-his成功轉(zhuǎn)入GS115；)圖5：GS115-pPIC9K-Irisin-his誘導(dǎo)上清SDS-PAGE電泳分析圖(第1泳道M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；第2～5泳道1-4為GS115-pPIC9K誘導(dǎo)1-4天上清；第6～9泳道5-8為GS115-pPIC9K-Irisin-his誘導(dǎo)1-4天上清；GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的誘導(dǎo)上清中，在14-29KDa之間含有四個大小不同本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人Irisin重組蛋白的DNA序列，其特征在于，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種人Irisin重組蛋白的DNA序列，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。2.一種人Irisin重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.含有權(quán)利要求1所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的DNA序列插入到畢赤酵母分泌表達(dá)載體中得到的表達(dá)人Irisin重組蛋白的DNA的重組表達(dá)載體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述畢赤酵母分泌表達(dá)載體為pPIC9K。6.一種轉(zhuǎn)基因重組菌，其特征在于，所述重組菌是將權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)至畢赤酵母中，篩選得到表達(dá)人Irisin重組蛋白的轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因重組菌，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：顧志良，何賽，郁建鋒，韓曜平，張燕萍，
申請(專利權(quán))人：常熟理工學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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