本發明專利技術公開了一種雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCCNo.6135，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體12H7。本發明專利技術還涉及單克隆抗體12H7在制備用于檢測β-Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體12H7的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體12H7在制備用于檢測β-Catenin相關性腫瘤的試劑盒中的應用。本發明專利技術所述單克隆抗體可與β-Catenin蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了β-Catenin蛋白免疫檢測的特異性和可靠性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域,特別涉及一種抗β-Catenin的單克隆抗體,產生該抗體的雜交瘤細胞株，以及該抗體的免疫檢測用途。
技術介紹
β -Catenin是環連蛋白家族中的一員，分子量約90kd,為一種多功能蛋白質； β -Catenin是新原癌基因的產物，可與二十多種蛋白質結合，也是一種具有介導細胞粘附及信號傳導雙重活性的多功能蛋白。β -Catenin蛋白有兩個重要功能，一方面它是重要的細胞粘附分子和細胞骨架成分，另一方面它又是fct信號通路中的一個重要成員，在發育過程中指導機體的正常發育，在腫瘤細胞中，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。編碼β-Catenin的基因稱為CTNNBl，定位于染色體3p21，全長23. 2kb，有16個外顯子；Van Nhieu等的研究顯示，CTNNBl突變所導致的Wnt信號傳導途徑異常激活，是惡性腫瘤發生的重要環節。β-Catenin蛋白在細胞中異常表達可見于人類多種惡性腫瘤。細胞中的β -Catenin以兩種形式存在游離β -Catenin以及與E_cadherin、APC蛋白等結合形成復合體的β-Catenin，二者共同組成一個“胞內β-Catenin庫”，并可互相轉換；正常情況下，兩者達成一種平衡，一旦這種平衡被打破，則可能造成惡性腫瘤的發生。Dong KyumWo等以及近年來的其他研究均顯示，β -Catenin異常的亞細胞定位、聚集與細胞惡性轉化、增殖密切相關，并在胃癌、結直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤中均得到類似結論。β-Catenin作為腫瘤預后的影響因素，在不同的組織器官具有不同的意義。β -Catenin的免疫組化(IHC)結果顯示，結腸癌中胞質和核染色增加可能是預后較差的獨立因素，而表達水平的降低或缺失是胃癌和胰腺癌的不良預后因素。β-Catenin核內高表達或細胞膜表達缺失的惡性黑色素瘤、乳腺癌和非小細胞肺癌的患者生存期短，預后差。目前臨床上通常通過免疫組織化學病理實驗檢測腫瘤細胞中β-Catenin的表達狀況。而IHC實驗的核心為一抗，即可特異性結合β-Catenin的單克隆抗體,其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性高的抗β -Catenin的單克隆抗體具有重要的意義。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題為提供一種結合特異性高的抗β-Catenin的單克隆抗體12Η7，及其在制備用于檢測β -Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應用。為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏日期為2012年5月16日，保藏編號為 CGMCC No. 6135。本專利技術還提供了一種特異性結合β-Catenin蛋白的單克隆抗體12Η7,由上述雜交瘤細胞株產生。本專利技術所述單克隆抗體的制備方法如下(I)重組表達載體的構建根據β-Catenin基因的ORF全序列(如SEQ ID No. I所示)設計引物進行PCR擴增，基因兩側分別引入限制性內切酶位點SgfI和Mlul，并在其C末端引入Myc-DDK標簽序列(標簽序列如SEQ ID No. 2所示),插入表達載體pCMV6_Entry,構建β -Catenin重組表達質粒(簡稱為pCMV6_CTNNBl)；(2) β -Catenin重組蛋白的表達與純化以pCMV6_CTNNBl質粒轉染HEK293T細胞，裂解離心取上清，DDK親和層析柱純化,獲得純化的β-Catenin重組蛋白；(3)單抗的篩選與制備采用上述β-Catenin重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗β-Catenin特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為12Η7，亞型鑒定為IgGl ;制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化β-Catenin單抗12Η7。分別通過Western Blot (結果見圖3)、免疫組化實驗(結果見圖4-6)驗證該單抗的靈敏度和特異性。專利技術人還通過OriGene高密度蛋白芯片驗證了上述單克隆抗體的特異性OriGene高密度蛋白芯片上包含10400種HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋 白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣,每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。將本專利技術單克隆抗體12H7與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯示本專利技術單克隆抗體12H7特異性結合β-Catenin蛋白，與其他蛋白無交叉反應。本專利技術的另一個目的在于提供一種單克隆抗體12Η7在制備用于檢測β -Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應用。具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。本專利技術還提供了上述單克隆抗體在制備用于診斷β -Catenin相關性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應用。由于β-Catenin蛋白的異常表達、異常亞細胞定位及聚集均與人類多種惡性腫瘤有關，因此使用本專利技術單克隆抗體檢測細胞中β-Catenin蛋白的表達狀況或亞細胞定位,可用于輔助診斷β -Catenin相關性腫瘤。所述β -Catenin相關性腫瘤為胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌、子宮內膜癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌或非小細胞肺癌。本專利技術還提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體12Η7 ;可用于檢測組織細胞中β -Catenin蛋白的表達狀況。本專利技術所述針對β-Catenin蛋白的特異性單抗12Η7,可與β-Catenin特異結合，提高了實驗的特異性和可靠性，并建立了基于單抗12Η7的免疫組織化學技術，主要用于大腸癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、食管癌、非小細胞肺癌等腫瘤的輔助診斷。保藏信息用于保藏的雜交瘤細胞株的科學描述為抗人CTNNBl單克隆抗體雜交瘤細胞株12Η7 ；保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位簡稱CGMCC ；保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏編號CGMCCNo. 6135。附圖說明 圖I為Western blot驗證β -Catenin重組質粒在ΗΕΚ293Τ細胞中的表達；左邊泳道的上樣樣品為轉染PCMV6空載體的ΗΕΚ293Τ細胞裂解液，右邊泳道的上樣樣品為轉染PCMV6-CTNNB1重組質粒的ΗΕΚ293Τ細胞裂解液，雜交所用一抗為抗DDK標簽抗體；圖2為β -Catenin重組蛋白的SDS-PAGE鑒定圖；圖3為單克隆抗體12Η7在9種不同細胞系中的Western blot結果；圖4為以單克隆抗體12H7為一抗，免疫組化法檢測胰腺組織中β -Catenin蛋白的表達；圖5為以單克隆抗體12Η7為一抗，免疫組化法檢測子宮內膜組織中β -Catenin蛋白的表達；圖6為以單克隆抗體12Η7為一抗，免疫組化法檢測前列腺組織中β -Catenin蛋白的表達。具體實施例方式為了使本領域的技術人員更好地理解本專利技術的技術方案，下面結合具體實施本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種特異性結合β？Catenin蛋白的單克隆抗體12H7，由保藏編號為CGMCC？No.6135的雜交瘤細胞株產生。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何為無，馬東輝，袁克湖，陳堅，王超，陳思，王宜，周春，
申請(專利權)人：無錫傲銳東源生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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