本發明專利技術公開了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，本發明專利技術采用的抗原為從甘蔗大田采集的成熟黑穗病病原菌孢子，經處理后在PDA培養基上培養獲得，其步驟包括：（1）黑穗病病原菌孢子的采集處理，制備抗原；（2）取等量抗原（真菌孢子、菌絲體胞外多糖或上清液）分別與福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑混合，乳化，頸背部皮下多點注射免疫新西蘭白兔；（3）每兩個星期免疫一次，共免疫四次，第八個星期后，頸動脈采血；（4）分離抗血清并純化，獲得目標多克隆抗體。本發明專利技術制備的多克隆抗體具有純度高，特異性好，效價高，保存長久等優點，對甘蔗科研中通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病具有重要意義，結合人工接種技術能提高甘蔗抗黑穗病育種效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物抗病性鑒定領域，具體是一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備。
技術介紹
甘鹿黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea syd)引起的一種真菌性病害，自1877年在南非的納塔爾地區首次被發現至今在全國的各個植蔗區均有此病發生的報道。此病是一種氣傳性病害，能夠導致蔗莖產量和蔗糖分的嚴重損失，隨著宿根年限的增加發病越來越嚴重，發病嚴重的品種和地塊發病率達到60%，因此病而淘汰了一批豐產高糖的甘蔗優良品種。防治此病最有效最經濟的方法是培育優良的甘蔗新品種，而抗病性的鑒定是抗病育種的基礎和關鍵，鑒定的準確性和效率直接影響到抗病育種的進程和效果。 目前，國內外還主要是通過鑒別寄主法對甘蔗進行抗黑穗病性鑒定，此法周期長，工作量大，耗資高，通常由實生苗育成新甘蔗品種的概率為1/100000，因此此法與甘蔗育種的大群體要求不相適用。隨著免疫學技術的發展成熟及其在動植物病原菌檢測上的成功應用，使得應用此方法檢測甘蔗黑穗病成為可能。該方法具有操作簡單，可同時檢測多個樣品等優點，符合甘蔗育種過程中大群體篩選的需求。但是，目前還未見有甘蔗黑穗病抗體制備的報道。因此，制備甘蔗黑穗病病原菌抗體并結合針刺接種技術，可在甘蔗實生苗期進行批量的篩選，提高篩選效率，縮短甘蔗抗黑穗病育種年限。
技術實現思路
本專利技術的目的為了克服已有對甘蔗進行抗黑穗病性鑒定的鑒別寄主法的周期長，工作量大，耗資高，提供一種具有純度高，特異性好，效價高，保存長久，對甘蔗通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病和人工接種提高甘蔗抗黑穗病育種效率的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備。本專利技術通過下述的技術方案來實現一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制備抗原，將抗原在PDA培養基上培養獲得到多克隆抗體，主要包括以下步驟(I)抗原采集和制備在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制備抗原(真菌孢子，菌絲體胞外多糖或上清液)備用；(2)抗原免疫培養將獲得的抗原與等量的福氏完全佐劑混合，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；第15天，取Iml抗原加入等量福氏不完全佐劑，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；每隔2周，按照所述的劑量和方法多次免疫白兔，在第八周測定效價達到要求后，頸動脈取血備用；(3)分離純化將步驟(2)獲得的抗血清進行分離純化，獲得甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體。以上所述的抗原采集和制備，主要步驟是(I)從甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，將白色薄膜去除后，將黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮紙袋中，然后于45°c中烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中備用；(2)將真菌孢子用無菌水按50-100個孢子/ml稀釋，涂布于含有50ng/ml鏈霉素的PDA固體培養基上，于28°C恒溫培養箱中培養3天，獲取單菌落后，挑取少許菌絲體到含有50ng/ml鏈霉素的PDA液體培養基中，于28°C恒溫培養箱中培養2天；(3)上清液抗原的制備量取適量步驟(2)的培養液，于冷凍離心機中4°C，4000r/min,5min離心，取上層清液作為抗原，放入_20°C冰箱中保存，備用；(4)菌絲體胞外多糖抗原的制備量取適量步驟(2)的培養液，于冷凍離心機中40C，4000r/min, 5min離心，吸取上清液，加入2倍體積的95%的乙醇，用滅菌的玻璃棒攪起絲狀沉淀物，再于冷凍離心機中4°C，4000r/min，IOmin離心，倒掉上清液后，用85%的乙醇 洗滌沉淀兩次，此沉淀物即為胞外多糖，室溫干燥乙醇揮發完全后，加入5ml的PBS后即為胞外多糖抗原，放入_20°C冰箱中保存，備用。以上所述的抗原免疫培養和分離純化，主要步驟是(I)用PBS將真菌孢子稀釋為2*108個/ml，分裝后凍存于_20°C冰箱；(2)第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐劑，乳化，將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點注射，免疫兩只新西蘭白兔；(3)兩周后，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑，乳化，將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中檢驗，不散開表明已達到要求；在頸背部皮下多點注射，免疫兩只新西蘭白兔；(4)每隔2周，按照步驟(3)所述的方法檢驗；( 5 )測定效價合格后，頸動脈取血；(6)兔血在4°C放置過夜，于4°C，10000rpmr/min冷凍離心機中離心30min，收集上清液。以上所述的多點注射是在頸背部皮下注射8-10點。以上所述的多克隆抗體應用于甘蔗抗黑穗病品種的育種。專利技術的優點及其積極效果本專利技術首次提出了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其優點在于特異性高，效價高，保存長久。應用此多克隆抗體結合針刺接種技術對甘蔗實生苗進行黑穗病抗性檢測較傳統的鑒別寄主法具有省時省力，節約物資，操作簡單及不受過多的外界環境干擾等優點。對甘蔗科研中通過免疫學方法檢測甘蔗黑穗病具有重要意義，結合人工接種技術能提高甘蔗抗黑穗病育種效率，可在甘蔗五圃制選育程序的前期階段淘汰感病品系，提高抗黑穗病品系在所選育的甘蔗優良品系中的比例，因此可用于甘蔗抗黑穗病品種的選育。具體實施例方式通過下面的實施例對本專利技術做進一步的詳細說明。實施例一I、黑穗病病原菌的獲得和孢子抗原制備在黑穗病高發的7-8月份，從甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，將白色薄膜去除后，將黑穗病孢子粉收集到牛皮紙袋中，然后于45°C中烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中。將孢子用無菌水稀釋后(約50-100個孢子/ml)涂布于含有50ng/ml鏈霉素的PDA固體培養基上于28°C恒溫培養箱中培養3天，獲取單菌落，將單菌落繼續培養獲取孢子粉，收集后于45°C烘干lh，用保鮮袋包好存于4°C冰箱中，此即黑穗病孢子抗原。2、多克隆抗體制備的免疫流程用PBS將真菌孢子稀釋為2*108個/ml，分裝后凍存于_20°C冰箱。第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐劑(Sigma公司，貨號F5881),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第15天,取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第29天，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506)，乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理 鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第43天,取取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐劑(Sigma公司，貨號F5506),乳化(檢驗乳化程度將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，在頸背部皮下多點(8-10點)注射，免疫兩只新西蘭白兔。第53天，測定效價合格后頸動脈取血。兔血在4°C放置過夜，于冷凍離心機中離心(4°C，10000r/min)30min，收集上清液，此即所獲得的以甘蔗黑穗病病原菌孢子為抗原的多克隆抗體。最終獲得多克隆抗體的量新西蘭白兔I為48ml ;新西蘭白兔2為45. 5ml。3、所獲得多克隆抗體免疫效果的Elisa檢查(I)孢子處理降黑穗病孢子本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗體的制備，其特征在于：采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制備抗原，將抗原在PDA培養基上培養獲得到多克隆抗體，主要包括以下步驟：（1）抗原采集和制備：在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制備抗原（真菌孢子，菌絲體胞外多糖或上清液）備用；（2）抗原免疫培養：將獲得的抗原與等量的福氏完全佐劑混合，乳化，在頸背部皮下多點注射，免疫新西蘭白兔；第15天，取1？ml抗原加入等量福氏不完全佐劑，乳化，在頸背部皮下多點（8？10點）注射，免疫新西蘭白兔；每隔2周，按照所述的劑量和方法多次免疫白兔，在第八周測定效價達到要求后，頸動脈取血備用；（2）分離純化：將步驟（2）獲得的抗血清進行分離純化，獲得目標多克隆抗體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊麗濤，宋修鵬，李楊瑞，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：
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