抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法技術

本發明專利技術涉及治療牛乳房炎的產品，公開了一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，包括以下步驟：(S1)、制取不同類的牛乳房炎致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。按本發明專利技術生產的產品具有對采用常規藥物治療無效的頑固性牛乳房炎的療效特別明顯；同時，還會明顯增強奶牛體內白細胞的吞噬功能，提升其抗病原體感染的能力；可直接給奶牛補充抗體，抑滅奶牛體內的病原體，消除感染，迅速降低鮮奶體細胞數。

【技術實現步驟摘要】
抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法
本專利技術涉及治療牛乳房炎的產品，尤其是涉及一種不產生耐藥性的可有效預防和治療各種細菌、真菌和霉形體以及病毒引發的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。
技術介紹
奶牛乳房炎是世界范圍內最常見而又最難防治的奶牛疾病之一。目前全世界約有2.2億頭奶牛，其中1/3患有各種類型的乳房炎。據統計，臨床型乳房炎占奶牛總發病的2成多，一般造成產奶量下降，乳液廢棄，嚴重時，患牛乳區腫脹硬化、化膿、壞疽甚至萎縮，失去泌乳能力，被迫淘汰，每年因乳房炎而最終淘汰的病牛約占總淘汰率的10％。在所有的牛乳房炎中，隱性乳房炎在奶牛群中最普遍，在一個牛群中，大多數乳房炎(大約90％)是隱性型。因此，造成經濟損失的主要是隱性乳房炎，其損失占每頭泌乳母牛每年總生產能力的10％～11％[。即使在飼養水平較高的發達國家，隱性乳房炎的發病率也在50％以上。因此，給世界各國以及我國的乳牛業造成相當大的經濟損失。目前，全球對奶牛乳房炎普遍采用抗生素進行治療。但是，使用抗生素治療一方面會造成牛乳中抗生素殘留，另一方面會誘發細菌產生耐藥性，使抗生素失效，造成慢性乳房炎特別是隱性乳房炎比例越來越來大。而且，抗生素只對細菌性乳房炎有一定療效，對由真菌和霉形體以及病毒引起的牛乳房炎是無效的。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種不產生耐藥性的可有效預防和治療各種細菌、真菌和霉形體以及病毒引發的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。本專利技術是通過以下技術措施實現的，一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，包括以下步驟：(S1)、制取不同類的牛乳房炎致病微生物抗原：分別按致病微生物的分類培養并純化一種或任意幾種同類不同種的致病微生物，按任意比例混合均勻，然后加以超聲粉碎；最后按重量1-10∶10-1的重量比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中，以8,000-30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，重復上述方法分別制得各類不同類的致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋：采用淘汰法篩選具有高免疫應答能力的選擇產蛋禽類，再分別采用上一步驟制備不同類的致病微生物抗原對高免疫應答能力的選擇產蛋禽類進行免疫；每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產免疫蛋，并進行編碼標記；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉：根據免疫所用不同類的致病微生物抗原，將免疫蛋分類并標記編碼，用流動水洗凈免疫蛋，再用蘇打水消毒，打蛋機打碎免疫蛋，篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水稀釋并混合均勻，用1.0NHCI溶液調pH至5.5-6.0，將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-60℃，靜置12小時-24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清液置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉水溶液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌均勻，40℃靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清液；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；使用除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即分別制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；最后，將所制備的對應不同致病微生物抗原的特異性TgY粗提物進行編碼標記；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：將同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉分別經過蛋白層析裝置進行純化處理，制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY：將所制備的不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分攪拌均勻，即制得抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。作為一種優選方式，所述步驟(S4)后為：步驟(S41)、制取納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：對各類所述抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進行納米化處理，制得不同類的納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；步驟(S42)、制取納米脂質體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：對各類所述納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進行脂質體化處理，制得不同類的納米脂質體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；所述步驟(S5)更換為步驟(S50)、制取納米脂質體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY：將所制備的不同類的納米脂質體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分攪拌均勻，即制得納米脂質體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。具體的，所述致病微生物包括致病細菌、致病真菌、致病霉形體以及病毒。更具體的，所述致病細菌包括致病細菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及乳房鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、星形諾卡氏菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、愛德華氏菌、腸桿菌、結核桿菌、多殺性巴氏桿菌和綠膿桿菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病真菌包括隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌和白色念珠菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病霉形體包括牛霉形體、牛生殖道霉形體和產堿霉形體中的任意一種或任意幾種組合；所述病毒包括口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒中的任意一種或任意幾種組合。其中所選的微生物來源為向ATCC(美國標準生物品收藏中心)購買以下代表性致病真菌和霉形體以及病毒(括號內數字是ATCC商品編號)，并采用常規方法培養和純化這些真菌和霉形體以及病毒：，1.細菌：無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae(編號：4768)停乳鏈球菌Streptococcusdysgalactiae(編號：6644)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(編號：BBA-1681)大腸桿菌Escherichiacoli(編號：35150)乳房鏈球菌Streptococcusuberis(編號：19436)肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae(編號：29011)星形諾卡氏菌Nocardiaasteroides(編號：9955)化膿鏈球菌Streptococcuspyogenes(編號：8669)表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis(編號：35983)變形桿菌Proteusvulgaris(編號：8427)愛德華氏菌Edwardsiellatarda(編號：15947)結核桿菌Mycobacteriumtuberculosis(編號：25177)多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida(編號：BBA-1113)綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa(編號：12175)2.真菌：隱球菌(編號：32040)、奴卡氏菌(編號：22338)、毛孢子菌(編號：4155)、煙曲霉菌(編號：1022)、酵母菌(編號：22873)、白色念珠菌(編號：)3.霉形體：牛霉形體(編號：27367)、牛生殖道霉形體(編號：14173)產堿霉形體(編號：29103)4.病毒：口蹄疫病毒(編號：VR-1432)、水皰性口炎病毒(編號本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于包括以下步驟：(S1)、制取不同類的牛乳房炎致病微生物抗原：分別按致病微生物的分類培養并純化任意一種或任意幾種同類不同種的致病微生物，按任意比例混合均勻，然后加以超聲粉碎；最后按重量1？10∶10？1的重量比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中，以8,000？30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，重復上述方法分別制得各類不同類的致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋：采用淘汰法篩選具有高免疫應答能力的選擇產蛋禽類，再分別采用上一步驟制備不同類的致病微生物抗原對高免疫應答能力的選擇產蛋禽類進行免疫；每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產免疫蛋，并進行編碼標記；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉：根據免疫所用不同類的致病微生物抗原，將免疫蛋分類并標記編碼，用流動水洗凈免疫蛋，再用蘇打水消毒，打蛋機打碎免疫蛋，篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4？6倍加入蒸餾水稀釋并混合均勻，用1.0N？HCI溶液調pH至5.5？6.0，將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2？60℃，靜置12小時？24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清液置超濾器中進行超濾濃縮10？20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉水溶液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌均勻，40℃靜置8？12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清液；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；使用除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即分別制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；最后，將所制備的對應不同致病微生物抗原的特異性TgY粗提物進行編碼標記；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：將同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉分別經過蛋白層析裝置進行純化處理，制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性復合IgY：將所制備的不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分攪拌均勻，即制得抗牛乳房炎致病微生物特異性復合IgY。...

【技術特征摘要】
1.一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于包括以下步(S1)、制取不同類的牛乳房炎致病微生物抗原：分別按致病微生物的分類培養并純化任意一種或任意幾種同類不同種的致病微生物，按任意比例混合均勻，然后加以超聲粉碎；最后按重量1-10:10-1的重量比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中，以8,000-30,000rpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，重復上述方法分別制得各類不同類的致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋：采用淘汰法篩選具有高免疫應答能力的選擇產蛋禽類，再分別采用上一步驟制備不同類的致病微生物抗原對高免疫應答能力的選擇產蛋禽類進行免疫；每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產免疫蛋，并進行編碼標記；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉：根據免疫所用不同類的致病微生物抗原，將免疫蛋分類并標記編碼，用流動水洗凈免疫蛋，再用蘇打水消毒，打蛋機打碎免疫蛋，篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水稀釋并混合均勻，用1.0NHCI溶液調pH至5.5-6.0，將調整好pH值的稀釋液進一步充分攪拌均勻，然后將其冷卻至2-60℃，靜置12小時—24小時；將稀釋液于10,000rpm離心20分鐘；取分離所得的上清液置超濾器中進行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2.0％海藻酸鈉水溶液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌至出現渾濁；再加入2.0％CaCl2液，稀釋至0.1％的濃度，攪拌均勻，40℃靜置8-12小時；8,000rpm離心20分鐘，取上清液；0.45μm膜串連0.22μm膜過濾除菌；使用除病毒過濾器除去病毒；冷凍干燥，即分別制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；最后，將所制備的對應不同致病微生物抗原的特異性IgY粗提物進行編碼標記；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：將同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉分別經過蛋白層析裝置進行純化處理，制得不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性復合IgY：將所制備的不同類的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分攪拌均勻，即制得抗牛乳房炎致病微生物特異性復合IgY。2.根據權利要求1所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于：所述步驟(S4)后為：步驟(S41)、制取納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品：對各類所述抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進行納米化處理，制得不同類的納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：包晟，楊榮鑒，包海威，張善鈞，汪玲，
申請(專利權)人：深圳雅臣生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：