一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體及其制備方法和應用技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，公開了一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體及其制備方法和應用。制備方法包括以下步驟：1)選取皮膚癬的兩種主要致病菌，培養這兩種皮膚癬菌，分別提取菌體的細胞壁蛋白；2)用步驟1)得到的蛋白制備抗原免疫母雞，共計五次，得到雞蛋，從雞蛋中提取、純化卵黃抗體；3)利用得到的IgY制備出抗皮膚癬菌的制劑。本發明專利技術利用皮膚癬致病菌的兩種細胞壁蛋白，制備出抗皮膚癬菌的卵黃抗體具有較強特異性，能夠有效的抑制皮膚癬菌，無毒副作用；本發明專利技術所述的方法易于大規模生產，成本低廉，工藝簡單，得到的是產品是一種非常安全的抗皮膚癬疾病的制劑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物制藥技術，特別涉及一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體及其制備方法和應用。
技術介紹
真菌廣泛的存在于世界各地，主要存在于土壤里及人和動物上。其中，常見的由真菌感染的疾病為皮膚癬。例如：腳氣，牛皮癬等。皮膚癬菌在增殖過程中深入到真皮層，刺激真皮層的神經系統引發瘙癢的癥狀；局部組織液聚集，皮膚組織破損后極易繼發細菌感染，導致炎癥反應，這類由于感染皮膚癬菌而引發的一系列皮膚組織病理現象稱為皮膚癬菌病。皮膚癬菌病是人類的常見病，至少有10-20％的世界人口可能感染這些病原體。近年來，由于抗生素和免疫抑制劑的廣泛應用，以及免疫缺陷病發病率上升等因素，使皮膚癬菌病的發病呈逐漸上升趨勢，加之人們保健意識的提高，因此皮膚癬菌病日益受到重視。皮膚癬菌病包括體癬、手足癬、股癬、面癬等。常見的皮膚癬菌分為三種、分別是毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬。其中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌為最常見兩種致病菌株，可以感染人體的頭部、軀干部、四肢，也是人類感染的最主要皮膚癬菌類型。這兩種菌均屬于毛癬菌屬，真菌結構相似，故通過兩種菌得到的血清抗體有交叉性，特異性不強。此外，特異性抗體的被動免疫是預防和治療傳染性疾病有效方法之一。免疫治療往往需要大量的特異性抗體。研制安全、高效價和廉價的抗體己是當前研究的熱點。1893年Klemperer發現存在于產卵母雞血清中的抗體轉移到卵黃中，在胚胎發育早期作為主要的免疫球蛋白為雛雞提供被動的免疫保護。因該抗體相似于哺乳動物IgG分子而又存在于卵黃中，故稱其為卵黃抗體(IgY)。由于從卵黃中分離純化IgY比較困難，此后在很長的時間里，人們只對雞的免疫系統和IgY的結構性質進行了相關研究。直到1980年，Poison等提出了PEG沉淀法，使得從卵黃中分離IgY變得簡單易行，自此國內外學者對IgY的應用進行廣泛的研究。IgY具有許多顯著的優點：①不需要殺生或者采血，只需收集免疫母雞產下的蛋經提取可得，符合現代動物保護法；②使用少量的抗原免疫禽類即可獲得大量的質量均一的特異性IgY，成本低，產量高；③由于種系發生距離相差很大,IgY不會與IgG發生交叉血清學反應；④IgY的性質更穩定，便于保存和應用；⑤與IgG相比，IgY非常重要的一個性能特點在于，不僅具有與抗原結合的能力，而且對其抗原菌的生長具有顯著的抑制作用。鑒于其擁有獨特的免疫化學性質，且適于生產特異性抗體，IgY在免疫治療和免疫診斷領域均有廣泛應用前景，其被動免疫功能可以用于抗病毒和細菌性疾病，具有開發功能性食品和新藥的潛能。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺點與不足，本專利技術的首要目的在于提供一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體的制備方法。本專利技術的再一目的在于提供一種由上述制備方法制備得到的抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體。本專利技術的又一目的在于提供一種利用上述抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：(1)選取紅色毛癬菌或須癬毛癬菌，先固體培養一周后采用液體培養；(2)液體培養后進行沖洗和離心，得到的菌絲經過液氮研磨，超聲破碎，離心得到細胞壁；利用冷堿抽提法提取真菌的細胞漿蛋白，離心得到上清液；將上清液透析后獲得皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原；(3)選取20周齡產蛋母雞；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml的皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按照體積比1:1混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml；首次免疫兩周后進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml，以后每隔15天進行加強免疫一次，一共加強免疫4次，從第一次加強免疫開始收集免疫雞蛋，并存放于4℃；(4)將獲得的免疫雞蛋用酒精消毒，破殼收集蛋黃，與凍存蒸餾水按照體積比為1:9混勻，離心獲得水溶性成分，采用PEG6000進行沉淀獲得卵黃抗體干粉，于-20℃保存。步驟(1)所述固體培養是采用SDA固體培養基；所述液體培養基是采用SDA液體培養基。步驟(2)所述液氮研磨的過程中加入10mMEDTA，10mMPMSF抑制蛋白酶。步驟(3)采用PEG6000沉淀法提取IgY，以及飽和硫酸銨溶液純化IgY，純化效果較好，得到的IgY也較為純凈。一種根據上述的制備方法制備得到的抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體。上述的抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體在制備預防和治療皮膚癬疾病的軟膏、噴劑、洗手液或濕紙巾中的應用，無毒副作用，安全可靠。所述皮膚癬疾病包括手癬、趾癬、體癬等。與現有技術相比，本專利技術具有以下優點及有益效果：本專利技術利用皮膚癬致病菌的兩種細胞壁蛋白，制備出抗皮膚癬菌的卵黃抗體具有較強特異性，能夠有效的抑制皮膚癬菌，無毒副作用；本專利技術所述的方法易于大規模生產，成本低廉，工藝簡單，得到的是產品是一種非常安全的抗皮膚癬疾病的制劑。附圖說明圖1為紅色毛癬菌細胞壁蛋白的IgY效價消長規律。圖2為須癬毛癬菌細胞壁蛋白的IgY效價消長規律。圖3為IgY的SDS-PAGE電泳圖，其中1為紅色毛癬菌細胞壁蛋白的IgY粗品；2為紅色毛癬菌細胞壁蛋白的IgY純品；3為須癬毛癬菌細胞壁蛋白的IgY粗品；4為須癬毛癬菌細胞壁蛋白的IgY純品。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。實施例1：皮膚癬菌蛋白抗原的制備(1)通過SDA固體培養基培養紅色毛癬菌和須癬毛癬菌，然后接種于液體培養基中大量培養，離心，用PBS沖洗，得到大量菌絲；(2)細胞壁蛋白的提取：對于(1)培養的菌絲，采用液氮研磨，加PBS溶解，加入10mMEDTA，10mMPMSF抑制蛋白酶；采用超聲細胞粉碎機及勻漿機破壁，菌絲細胞質釋放，離心分離得到細胞壁；加入4℃，0.1NNaOH于細胞壁沉淀中，在4℃下攪拌24h，4℃，12000g，10min離心后得到濾液，用預冷的1mol/l的HCl中和濾液；將濾液用50mMTris-Hcl透析三天，即為皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原。將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml的皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液，備用。實施例2：抗皮膚癬菌卵黃抗體的制備(1)用抗皮膚癬抗原免疫產蛋母雞選取20周齡產蛋母雞12只；將實施例1所得皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按照體積比1:1混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml；首次免疫兩周后進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml，以后每隔15天進行加強免疫一次，一共加強免疫4次，從第一次加強免疫開始收集免疫雞蛋，連續收集三個月的免疫雞蛋，按照天數進行編號，并存放于4℃；(2)抗抗皮膚癬特異性卵黃抗體的提純將獲得的免疫雞蛋用酒精進行消毒，雞蛋破殼去膜收集蛋黃，測定蛋黃體積，加入蛋黃3倍體積的3.5％的PEG6000的PBS溶液混勻，調節PH為7.2，攪拌40min后，4℃保存過夜；4℃，10000g離心20min后取上清液，用四層紗布過濾，得到的濾液，測定濾液體積；濾液中加入PEG6000粉末使最終本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：(1)選取紅色毛癬菌或須癬毛癬菌，先固體培養一周后采用液體培養；(2)液體培養后進行沖洗和離心，得到的菌絲經過液氮研磨，超聲破碎，離心得到細胞壁；利用冷堿抽提法提取真菌的細胞漿蛋白，離心得到上清液；將上清液透析后獲得皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原；(3)選取20周齡產蛋母雞；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml的皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按照體積比1:1混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml；首次免疫兩周后進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml，以后每隔15天進行加強免疫一次，一共加強免疫4次，從第一次加強免疫開始收集免疫雞蛋，并存放于4℃；(4)將獲得的免疫雞蛋用酒精消毒，破殼收集蛋黃，與凍存蒸餾水按照體積比為1:9混勻，離心獲得水溶性成分，采用PEG6000進行沉淀獲得卵黃抗體干粉，于?20℃保存。

【技術特征摘要】
1.一種抗皮膚癬菌的特異性卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：(1)選取紅色毛癬菌或須癬毛癬菌，先固體培養一周后采用液體培養；(2)液體培養后進行沖洗和離心，得到的菌絲經過液氮研磨，超聲破碎，離心得到細胞壁；利用冷堿抽提法提取真菌的細胞漿蛋白，離心得到上清液；將上清液透析后獲得皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原；(3)選取20周齡產蛋母雞；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原用PBS緩沖液稀釋成1mg/ml的皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液；將皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑按照體積比1:1混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml；首次免疫兩周后進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與皮膚癬菌細胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多點注射的免疫方式對每只母雞注射0.5ml，以后每隔15天進行加強免疫一次，一共加強免...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙肅清，胡青青，焦洛瑩，夏娜娜，呂瑞，梁雨欣，
申請(專利權)人：廣東工業大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44