改進的抗-血清白蛋白結合變體制造技術

本發明專利技術涉及抗-血清白蛋白免疫球蛋白單可變結構域DOM7h-11的改進的變體，以及包含這種變體的配體和藥物綴合物、組合物、核酸、載體和宿主。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】改進的抗-血清白蛋白結合變體本專利技術涉及抗-血清白蛋白免疫球蛋白單一可變結構域D0M7h-ll的改進的變體， 以及包含這種變體的配體和藥物綴合物、組合物、核酸、載體和宿主。專利技術背景W004003019和W02008/096158公開了具有治療有用的半衰期的抗_血清白蛋白(SA) 結合部分，如抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域(dAbs)。這些文獻公開了單體抗-SA dAbs 以及包含這種dAbs的多特異性配體，例如，包括抗-SA dAb和特異性結合目標抗原如TNFRl 的dAb的配體。公開了特異性結合來自多于一個物種的血清白蛋白的結合部分，例如人/ 小鼠交叉反應的抗-SA dAbs。W005118642和W02006/059106公開了為了增加藥物的半衰期而將抗-SA結合部分，如抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域，綴合或結合至藥物的概念。其公開并例舉了蛋白、肽和新的化學實體(NCE)藥物。W02006/059106公開了使用這種概念以增加促胰島素釋放試劑(insulintropic agents),例如,腸降血糖素激素如胰高血糖素樣肽(GLP)-1的半衰期。還可參考Holt攀，“Ant1-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs，，，Protein Engineering, Design & Selection, vol 21，no 5，pp283-288, 2008。W02008/096158 公開了一種很好的抗-SA dAb，D0M7h_ll。 期望提供作為D0M7h-ll的變體并特異性結合血清白蛋白，優選來自人和非人物種的白蛋白的改進的dAbs，這將在疾病的動物模型中以及對于人的治療和/或診斷提供實用性。還期望在相對溫和和高親和力的抗-SA結合部分(dAbs)之間提供選擇。這種部分可以連接至藥物，根據設想的最終應用選擇抗-SA結合部分。根據抗-SA結合部分的選擇，這允許更好地定制藥物以治療和/或預防慢性或急性適應癥。還期望提供是單體或者在溶液中基本上如此的抗-SA dAbs。以拮抗受體為目的，當抗-SA dAb被連接到特異性結合細胞表面受體如TNFRl的結合部分例如dAb時，這是特別有利的。抗-SA dAb的單體狀態在減少受體交聯的機會中是有用的，因為可以結合并交聯細胞表面上的受體(例如，TNFR1)的多聚體形成的可能性更小，從而增加了受體激動和有害的受體信號傳遞的可能性。PCT/EP2010/052008 和 PCT/EP2010/052007 公開了許多改進的 dAbs，其公開內容被引用并入。還期望提供具有改進穩定性的改進的dAbs。這對于允許dAb具有合適的穩定性特征或儲存時間是有利的。具體而言，期望提供具有暴露于升高的溫度后耐受解折疊 (unfolding)的改進的能力，即改進的熱穩定性，的dAbs。還期望提供當形式為構建體如多特異性配體或者當綴合于蛋白、肽或NCE時具有改進的穩定性的dAbs。專利技術概述本專利技術的方面解決了這些問題。為了這個目的，本專利技術人驚訝地發現，可以對D0M7h_ll系的免疫球蛋白單一可變結構域分子進行突變，得到由相對于母體D0M7h-ll分子的改進的熱穩定性所測定的分子的改進的穩定性。在一個方面中，提供了 D0M7h-ll(D0M7h-ll如附圖說明圖1中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單一可變結構域變體，所述變體具有至少54°C的1 。在另一個方面中，提供了 D0M7h-ll(D0M7h-ll如圖1中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單一可變結構域變體，所述變體具有高于54°C的Tm。轉化中點(Tm)為其中50%蛋白是在其天然構象并且其它50%是變性的溫度。合適地，通過差示掃描量熱法測定所述Tm。在一個實施方案中，與D0M7h_ll相比，所述變體在22、42或91位(根據Kabat 編號)中任何位置包含至少一個突變。合適地，抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體是 D0M7h-ll-15(D0M7h-ll-15 如圖 1(SEQ ID NO 7)中所示)的變體，與 D0M7h_ll_15 相比， 在22、42或91位(根據Kabat編號)中任何位置包含至少一個突變。在一個實施方案中， 變體包含選自下列的至少一個突變22 位=Ser、Phe、Thr、Ala 或 Cys ;42 位=Glu 或 Asp ；91 位=Thr 或 Ser ；在其它實施方案中，提供了抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中22位是Ser 或Phe ;抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中42位是Glu和91位是Thr ;抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中91位是Thr ;抗-3么免疫球蛋白單一可變結構域變體， 其中22位是Phe。在一個實施方案中，108位是Trp。進一步的實施方案提供了變體，所述變體包含與選自D0M7h-ll-56 (SEQ ID NO: 412)、D0M7h-l 1-68 (SEQ ID NO :416)、D0M7h_l 1-79 (SEQ ID NO :418)和 D0M7h-ll_80 (SEQ ID NO 419)的單一可變結構域的氨基酸序列相同的氨基酸序列(或者所述變體具有與選擇的氨基酸序列的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸)或者與選擇的氨基酸序列相比具有最多達4個改變的氨基酸序列。尤其地，已經發現，針對D0M7h-ll的FW3 (57-88位，根據Kabat編號)和CDR3區 (89-97位，根據Kabat編號)的突變賦予改進的穩定性。因此，在另一個實施方案中，提供了與本專利技術的一個方面一致的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中，與D0M7h-ll 相比，所述變體在FW3區中(57-88位，根據Kabat編號)或在CDR3區中(89-97位，根據 Kabat編號)包含至少一個突變。進一步的實施方案提供了抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域，其中所述變體是 D0M7h-l 1-15 (D0M7h-l 1-15如圖1中所示)的變體，與D0M7h_ll_15相比，所述變體在FW3 區中(57-88位，根據Kabat編號)或在CDR3區中(89-97位，根據Kabat編號)包含至少一個突變。合適地，所述變體在77、83、93或95位(根據Kabat編號)中任何位置包含至少一個突變。在一個實施方案中，變體包含選自下列的至少一個突變77 位=Asn、Gln83 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸。93 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸。95 位=His、Asn、Gin、Lys 或 Arg。 在另一個實施方案中，本專利技術的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域在106或108 位(根據Kabat編號)還包括突變。合適地，106位是Asn或Gin。合適地，108位是Trp、 Tyr 或 Phe。在進一步的實施方案中，提供了抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中77 位是Asn ;抗-SA單一可變結構域，其中83位是Val ;抗-SA單一可本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.05.20 US 61/346,5191.D0M7h-ll(D0M7h-ll如圖1(SEQ ID NO:438)中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白單一可變結構域變體，所述變體具有至少54°C的Tm。2.權利要求1要求保護的抗-SA免疫球蛋白，其中所述變體與D0M7h-ll相比在22、42或91位(根據Kabat編號)中任何位置包含至少一個突變。3.權利要求2要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中所述變體是D0M7h-l 1-15 (D0M7h-l 1-15 如圖1 (SEQ ID NO 2)中所示)的變體，與 D0M7h_ll_15 相比在22,42或91位(根據Kabat編號)中任何位置包含至少一個突變。4.權利要求1-3中任一項的變體，其中所述變體包含選自下列的至少一個突變22 位=Ser、Phe、Thr、Ala 或 Cys ;42 位=Glu 或 Asp ；91 位=Thr 或 Ser。5.權利要求4要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中22位是Ser或Phe06.權利要求4要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中42位是Glu，91位是Thr。7.權利要求4要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中91位是Thr。8.權利要求4要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中22位是Phe。9.權利要求1或2的變體，其中所述變體包含與選自D0M7h-l1-56 (SEQ ID N0:412)、D0M7h-ll-68 (SEQ ID N0:416)、D0M7h_ll_79 (SEQ ID N0:418)和 D0M7h-ll_80 (SEQ IDN0:419)的單一可變結構域的氨基酸序列相同或者與所述選擇的氨基酸序列相比具有最多達4個改變的氨基酸序列。10.權利要求4要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中，與D0M7h-ll相比，所述變體在FW3區中(57-88位，根據Kabat編號)或在CDR3區中(89-97位，根據Kabat編號)包含至少一個突變。11.權利要求7要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中所述變體是D0M7h-ll-15(D0M7h-ll-15如圖1中所示)的變體，與D0M7h_ll_15相比，在FW3區中(57-88位，根據Kabat編號)或在CDR3區中(89-97位，根據Kabat編號)包含至少一個突變。12.權利要求7或8要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中所述變體在77、83、93或95位(根據Kabat編號)中任何位置包含至少一個突變。13.權利要求7-9中任一項的變體，其中所述變體包含選自下列的至少一個突變77 位=Asn、Gln83 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸93 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸95 位=His、Asn、Gin、Lys 或 Arg014.前述任一權利要求要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，在106或108位(根據Kabat編號)進一步包括突變。15.權利要求14要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中106位是Asn或 Gin。16.權利要求14要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中108位是 Trp、Tyr 或 Phe017.前述任一權利要求要求保護的抗-SA免疫球蛋白單一可變結構域變體，其中77位是 Asn018.前述任一權利要求要求保護的抗-SA單一可變結構域，其中83位是Val。19.前述任一權利要求要求保護的抗-SA單一可變結構域,其中95位是His。20.前述任一權利要求要求保護的抗-SA單一可變結構域,其中95位是His。21.前述任一權利要求要求保護的抗-SA單一可變結構域，其中93位是Val。22.權利要求1的變體，其中所述變體包含與選自D0M7h-ll-57(SEQ ID N0:413)、 D0M7h-ll-65 (SEQ ID N0:414)、D0M7h_ll_67 (SEQ ID N0:415)和 D0M7h_ll_69 (SEQ ID N0:417)的單一可變結構域的氨基酸序列相同或者與所述選擇的氨基酸序列相比具有最多達4個改變的氨基酸序列，條件是所述變體的氨基酸序列具有如權利要求1-12中任一項所定義的FW3或⑶R3區中的至少一個突變。23.權利要求10-21中任一項要求保護的變體，所述變體具有至少57°C的Tm。24.前述任一權利要求要求保護的變體，其中所述變體與D0M7h-ll相比具有增加的Tm值。25.前述任一權利要求要求保護的變體，其中所述變體與D0M7h-ll-15相比具有增加的Tm值。26.前述任一權利要求要求保護的變體，包括權利要求4和13中列出的任何突變的任何組合。27.前述任一權利要求的變體，其中所述變體包含結合位點，如表面等離子體共振所測定的，所述結合位點以約O.1-約10000 n...

【專利技術屬性】
技術研發人員：E德安格利斯，C埃納弗，H劉，O肖恩，M普佩卡斯維德，
申請(專利權)人：葛蘭素集團有限公司，
類型：
國別省市：