本發明專利技術涉及一種重組蛋白及其方法和應用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用，其氨基酸序列表如SEQ?ID?NO：1所示，制備時，將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質粒pET-15b的克隆位點中構建重組質粒，重組質粒轉化大腸桿菌BL2細胞，進行重組蛋白的表達，最后進行重組蛋白轉化體的純化收集，本發明專利技術的重組蛋白可應用于腫瘤治療藥物。本發明專利技術將腫瘤特異性抗原和轉導蛋白以及體外誘導DC細胞的關鍵試劑GM-CSF結合，制備出具有特異性且能延緩DC細胞壽命的融合蛋白，保證了DC細胞存活時間的延長以及特異性免疫應答的啟動；避免了常規DC細胞培養中GM-CSF的額外添加，解決了培養周期中GM-CSF不足的缺點，并且共表達GM-CSF還可促進細胞毒作用；為腫瘤臨床治療提供了新的依據。
【技術實現步驟摘要】
—種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用本專利技術涉及一種重組蛋白及其方法和應用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用。腫瘤發生發展的根本原因之一是機體的免疫系統不能對其生長進行有效地控制， 對此加以糾正，使機體的免疫系統能有效產生對腫瘤細胞的免疫排斥反應是近百年來人們一直研究的課題。腫瘤疫苗是該方面研究的主要內容，在眾多的腫瘤疫苗中，根據抗原提呈細胞在腫瘤免疫中的重要作用而設計的樹突狀細胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最熱門方向。機體的免疫應答首先由抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)捕獲、加工和處理抗原，再將抗原遞呈給T，B淋巴細胞，從而引發一系列的免疫應答。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)作為功能最強的APC,能激活靜息型T細胞(naive T cell), 激發初始免疫應答，在體內發揮強大的免疫監視功能。腫瘤患者體內DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導致免疫無能或免疫耐受，使腫瘤得以發生發展。應用DC瘤苗治療腫瘤最引人矚目的研究工作是應用抗原或抗原多肽在體外沖擊致敏(pulsing) DC，然后將之回輸或免疫接種至行瘤宿主，進行腫瘤免疫治療，已證明該療法能顯著地誘導機體產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應并能治療已建立的荷瘤模型，這些研究為腫瘤的治療提供了新的思路，將DC過繼回輸已在臨床用于腫瘤病人的治療，取得了一定療效，表明該療法具有一定的臨床應用的可行性。DC的抗原遞呈功能是DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的基礎，DC的體外大量誘導擴增是 DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的前提，DC瘤苗的體外構建是DC瘤苗的抗腫瘤免疫治療的關鍵。 針對現階段應用常規方法所誘導的DC細胞具有抗原特異性不高以及過早凋亡等方面的不足。本專利技術提供了一種GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白的制備方法，使誘導的DC細胞在抗原特異性和生存周期上都有了很大程度的提高，為后續的特異性免疫應答提供了很好的基礎條件。本專利技術為腫瘤免疫治療奠定了良好的基礎。為實現上述目的，設計一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，其氨基酸序列表如SEQ ID NO 1所示。本專利技術還涉及一種制備上述重組蛋白的方法，該方法由以下步驟組成a.將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質粒pET_15b的克隆位點中構建重組質粒，b.重組質粒轉化大腸桿菌BL2細胞，進行重組蛋白的表達，c.重組蛋白轉化體的純化收集通過N1-NTA柱分離純化所述的重組蛋白。在所述的步驟(a)中的酶切為在GM-CSF的基因序列兩端添加酶切位點Nde I和 Nco I，在TAT的基因序列兩端添加酶切位點Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列兩端添加酶切位點BamH I和Xho I。本專利技術的重組蛋白可應用于腫瘤治療藥物。本專利技術還包括一種上述重組蛋白制備DC疫苗的方法，將所述重組蛋白刺激誘導健康C57BL/6小鼠經由骨髓制備的DC細胞，制得DC疫苗。所述的重組蛋白的濃度為25 100ug/ml,優選為25 50ug/ml。本專利技術將特異性的腫瘤抗原與DC瘤苗相關因子基因相重組，得到可腫瘤免疫治療所需的特異、高效的重組蛋白。無論從理論上還是實際治療上都有著很大的進步。隨著 DC體外誘導擴增技術的發展及分子生物學技術和基因工程技術應用于DC瘤苗構建方法的發現，使得產量增大、純度提高、制備更容易等優點，更能滿足實驗和臨床研究的需要。DC 瘤苗用于腫瘤免疫治療的實驗和臨床研究更趨成熟，DC瘤苗有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。故專利技術了一種腫瘤特異性抗原結合細胞因子等刺激DC細胞制備DC疫苗所需的 GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，并可有效激發體內抗原特異性免疫反應用于腫瘤的預防及治療。與常規利用腫瘤細胞裂解物誘導DC細胞的方法相比，本專利技術創新優越之處有以下幾點首先，利用基因工程方法將腫瘤特異性抗原和轉導蛋白以及體外誘導DC細胞的關鍵試劑GM-CSF結合，制備出具有特異性且能延緩DC細胞壽命的融合蛋白，保證了 DC細胞存活時間的延長以及特異性免疫應答的啟動；其次，重組蛋白的成功制備，避免了常規DC 細胞培養中GM-CSF的額外添加，解決了培養周期中GM-CSF不足的缺點，并且共表達GM-CSF 還可促進細胞毒作用；再者增強了腫瘤抗原的特異性，針對性的解決了以CEA為標志性抗原的腫瘤免疫治療，為腫瘤臨床治療提供了新的依據。[附圖說明]圖1是不同疫苗刺激機體ELSPOT檢測IFN-gama斑點數的圖表，圖2是不同疫苗刺激機體特異性反應ELSPOT檢測IFN-gama斑點數的圖表，圖3是不同組腫瘤塊體積的圖表，圖4是不同劑量重組蛋白刺激機體特異反應ELSPOT檢測分析圖表，圖5是MC-38-cea2細胞毒實驗圖表，圖6是MC38細胞毒實驗圖表，圖7圖7是質粒pET-15b的圖譜[具體實施方式]為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本專利技術進行進一步詳細說明。本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。實施例1:本實施例中人源結腸癌Lovo細胞株特異性抗原CEA來自NCBI，序列號為CAE75559 ；TAT跨膜肽來自NCBI，序列號為NP_057853，粒細胞集落刺激生長因子GM-CSF來自NCBI，序列號為AAA52578。質粒pET_15b圖譜如圖7所示，a、利用基因合成技術，分別合成人源結腸癌Lovo細胞株特異性抗原CEA的基因序列、TAT跨膜肽的基因序列以及GM-CSF的基因序列。其中，粒細胞集落刺激生長因子 GM-CSF基因序列兩端加酶切位點Nde I和Nco I ；TAT跨膜肽的基因序列兩端加酶切位點 Xho I和Nde I ;在CEA基因序列兩端加酶切位點BamH I和Xho I ;利用基因重組技術將合成的這三段基因序列通過酶切克隆到質粒pET-15b上面構建成重組質粒；再將重組質粒轉染大腸桿菌BL2細胞，并確保細胞密度在2 X IO6進行轉染，37°C培養4天后取出細胞懸液； 利用N1-NTA柱分離純化GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，即可得到GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白， 其氨基酸序列為 GM-CSF27-138aa-TAT47-57-CEA605-613，詳細如 SEQ ID NO:1 所示。其中結腸癌Lovo細胞株和質粒pET_15b為本公司所有；其中CEA、TAT跨膜肽和粒細胞集落刺激生長因子GM-CSF的相關基因序列為第三方合成提供。b、構建表達人源CEA的小鼠結腸癌細胞株MC-38，即 MC-38_cea2細胞株，并用 DMEM培養基，10%熱滅活的胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，2mmol的L-谷氨酰胺進行培養；C、選取C57BL/6小鼠，并以IX IO6個細胞數量按照每2天進行腹腔注射，以構建 MC-38-cea2動物模型；d、取健康C57BL/6小鼠四肢骨骨髓制備成單細胞懸液，去除紅細胞，加入完全培養基、IL-4等細胞因子，體外誘導出小鼠DC細胞，再加入已獲得的GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，37°C、5%C02本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種GM?CSF??TAT???CEA?重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉永清，張超，蘇國新，
申請(專利權)人：上海柯萊遜生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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