本發明專利技術涉及免疫學領域,具體公開了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備樹突狀細胞腫瘤疫苗的方法，a.構建載有CEA抗原肽基因的穿梭載體質粒，并利用293細胞包裝成載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA,b.DC細胞的分離,培養和鑒定,c.利用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得AdCEA-DC疫苗,c.AdCEA-DC疫苗的細胞學實驗。本發明專利技術利用腺病毒作為基因載體，將CEA抗原肽基因高效轉入DC細胞，通過內源性內持續刺激獲得了具有高效呈遞癌胚抗原CEA抗原肽能力的DC疫苗，并可以誘導特異性的CTL，解決了現有技術獲得的DC疫苗呈遞抗原能力較弱，特異性不強的問題。
【技術實現步驟摘要】
一種CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的制備方法
本專利技術涉及免疫學領域。具體涉及了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備CEA陽性腫瘤特異性樹突狀細胞疫苗的方法。
技術介紹
胃癌和大腸癌是目前我國發病率很高的惡性腫瘤，胃癌占消化道惡性腫瘤的第一位，大腸癌發病率已經上升到第四位。目前大腸癌，胃癌首選的有效治療方法仍是手術切除，但切除率較低，復發轉移較高。術后綜合治療以放療，化療為主，但毒副作用大，患者往往難以接受。因此，胃癌和大腸癌預后欠佳，需要尋找新的更有效的治療方法。隨著科學的不斷進展，腫瘤的生物治療異軍突起，已經成了繼手術，放療，化療后的第四大腫瘤治療技術，在改善患者生存質量，降低復發率方面的重要作用已經得到越來越多的認可和重視。樹突細胞(dendritic cells, DC)是人體內功能最強大的專職抗原呈遞細胞(antigen process cells, APC),能誘導出抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反應,在人體抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用。DC細胞表面的MHC分子可以和腫瘤抗原結合，然后遞呈給T細胞，誘導T細胞活化，激活初始免疫應答，在體內發揮免疫監視功能。因此自從DC強大的遞呈抗原功能被發現以來，就得到了人們的廣泛關注，目前國內外圍繞以DC為核心的抗腫瘤免疫治療研究積累了大量的經驗。不過盡管以DC為基礎的免疫治療副作用輕微，能誘導出一定的抗腫瘤免疫反應，多數研究所獲得的臨床效果還是 有限。癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結腸及結腸癌的提取物中發現，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現出復雜的表達模式，尤其是CEA表現出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統產生針對CEA的免疫應答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。最早是在1965年由加拿大學者Gold和Freedman首先從胎兒結腸及結腸癌的提取物中發現，在多種類型的腫瘤上都有表達。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90%以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70%以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。CEA在正常組織、癌組織和胚胎中表現出復雜的表達模式，尤其是CEA表現出選擇性的上皮細胞表達。盡管CEA在一些正常組織中也有微量存在，但它在腫瘤組織中的表達遠遠高于正常組織。因此CEA是一種比較理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活機體免疫系統產生針對CEA的免疫應答，故而人們一直尋求多種途徑增強CEA的免疫原性。目前腫瘤的基因治療也已經成了一個熱點。腺病毒是一種DNA雙鏈無包膜病毒，基因組為36kb，基因背景清楚，在美國應用多年，證明對人體是無害的。腺病毒載體以其宿主范圍廣，轉染效率高，不整合到宿主基因組中，僅瞬時表達，安全性高，易制備高滴度腺病毒等優點而成為人類基因治療中最理想的病毒載體之一。一般將El或E3基因缺失的腺病毒載體稱為第一代腺病毒載體，El基因缺失喪失復制能力，但可以在El補償細胞如293細胞中復制。
技術實現思路
針對現階段應用常規方法所誘導的DC細胞受腫瘤免疫抗原性強度影響大，免疫激發力較弱等方面的不足。本專利技術提供了一種腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備DC細胞疫苗的方法，使獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗具有更強的免疫激發能力，并且不需要制備腫瘤抗原，讓DC疫苗的制備不再受腫瘤細胞來源較少，抗原蛋白成本較高的限制。為實現上述目的，設計一種一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，該方法由以下步驟組成: a.構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA； b.分離和培養DC細胞； c.采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC。在所述的步驟(a)中將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染293細胞，培養至出毒，得到原代毒種；用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA。在所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。在所述的步驟(C)中，包括以下步驟: Cl:采用步驟A中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟B中制備的DC細胞； C2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養液，于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養步驟Cl中感染后的DC細胞； C3:到第5天，在步驟C2中培養的DC細胞中加入TNF-α，繼續培養3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CDla，CD80，CD83，CD86，HLA-DR0所述的步驟A中所述的重組腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，該病毒缺失El區和E3區，并且在El區位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表達盒，該表達盒依次包括:啟動子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因編碼序列，聚腺苷酸信號序列。所述的步驟A中所述的癌胚抗原CEA抗原肽，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所/Jn ο所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC，是通過腺病毒為載體將癌胚抗原CEA抗原肽基因轉入DC細胞中獲得的，可以表達癌胚抗原CEA抗原肽基因。所述的步驟C獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC，CEA抗原肽基因陽性表達率在20%-100%。所述的步驟C中獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC可誘導出對CEA表達陽性腫瘤細胞有特異性殺傷作用的CTL。根據本專利技術，所述的載有CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA是通過AdMax系統包裝得到的。所述的DC細胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離收集人的外周血單個核細胞，培養l_2h后棄取懸浮細胞，留下貼壁細胞得到的。所述的GM-GSF的濃度為1000U/mL，IL-4的濃度為1000U/mL，TNF-a的濃度為200U/mL。從用腺病毒AD-CEA感染分離到的DC細胞到CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA-DC的成熟需培養8天。與現有技術相比，本專利技術創新優越之處有以下幾點:首先，首次使用腺病毒載體介導癌胚抗原CEA抗原肽基因轉染制備樹突狀細胞，獲得了 CEA陽性腫瘤特異性的DC疫苗；其次，所使用的癌胚抗原CEA抗原肽基因相對CEA全長基因選擇了有效序列，具有更強的特異性；再者，只是將腺病毒作為一個載體來轉染DC細胞，獲得成熟的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟：a.?構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD?CEA；b.?分離和培養DC細胞；c.?采用重組腺病毒AD?CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA?DC。
【技術特征摘要】
1.一種CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟: a.構建載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重組腺病毒AD-CEA； b.分離和培養DC細胞； c.采用重組腺病毒AD-CEA轉染DC細胞，獲得CEA陽性腫瘤特異性DC疫苗AdCEA_DC。2.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(a)包括如下工藝步驟: al:將載有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染293細胞，培養至出毒，得到原代毒種； a2:用原代毒種感染293細胞，待2-3天細胞病變后，進行濃縮純化，獲得擴增后的重組腺病毒AD-CEA 。3.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(b)中的DC細胞包括下列細胞:外周血單個核細胞培養的DC細胞，骨髓來源的DC細胞，臍帶血來源的DC細胞。4.根據權利要求1所述的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟(c)包括如下工藝步驟: cl:采用步驟(a)中制備的重組腺病毒AD-CEA病毒液感染步驟(b)中制備的DC細胞； c2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培養液，于37°C，5%C02的培養箱中繼續培養步驟(Cl)中感染后的DC細胞； c3:到第5天，在步驟(c2)中培養的DC細胞中加入TNF-α，繼續培養3天，第8天獲得的CEA陽性腫瘤特異性DC細胞疫苗AdCEA-DC，光鏡下形態學鑒定，并用流式細胞儀檢測細胞表型 CD...
【專利技術屬性】
技術研發人員：付建喜，葉永清，蘇國新，
申請(專利權)人：上海柯萊遜生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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