本發明專利技術公開了甘膽酸特異性半抗原、基于該半抗原的甘膽酸特異性單克隆抗體的制備方法以及用于檢測甘膽酸的免疫層析檢測方法。上述特異性單克隆抗體是由甘膽酸特異性半抗原偶聯蛋白免疫動物獲得的。本發明專利技術的甘膽酸特異性半抗原在與蛋白偶聯后制備的免疫原保留了甘膽酸的特異性活性位點，獲得的單克隆抗體與其他8種膽汁酸交叉均小于10％。用上述甘膽酸特異性單克隆抗體制備的時間分辨免疫層析試紙可以快速地測定樣本中甘膽酸的含量，提高現有甘膽酸臨床診斷的特異性和準確性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫檢測領域。具體而言涉及一種甘膽酸半抗原、以及使用該甘膽酸 半抗原制備的抗體以及使用所制備抗體的免疫檢測試劑。具體而言涉及一種甘膽酸時間分 辨熒光免疫測試條，測試條所用的抗體是用合成的甘膽酸免疫原免疫小鼠制備的甘膽酸特 異性單克隆抗體。
技術介紹
甘膽酸（Cholyglycine, CG)是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一。在肝細 胞內，膽固醇經過及其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸，其中有膽酸（CA)和鵝去氧膽 酸（CD-CA)膽酸、鵝脫氧膽酸（CDCA)和脫氧膽酸（DCA)等。膽酸的類固醇核上有三個羥基 (C3、C7、C12)，側鏈末端的羧基以肽鍵與甘氨酸結合，形成甘膽酸，分子量為465. 63,結構如 式1， 甘膽酸正常代謝途徑為腸一肝循環，先由肝細胞合成，經毛細膽管、膽管排入膽 囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物消化。95%甘膽酸在回腸末端重吸收，經門靜脈再回 肝臟，由肝細胞攝取再利用。正常情況下，肝臟能有效攝取門靜脈血中99%以上的甘膽酸， 僅有1 %甘膽酸進入體循環，因此外周血中甘膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐后，其 血清甘膽酸濃度穩定在低水平。 當肝細胞受損時，肝細胞攝取甘膽酸能力下降，致使血中甘膽酸含量增高；膽汁 郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的甘膽酸含量增高，也使血甘膽酸含量增 高。臨床證明，各種肝臟疾病如：肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘膽酸水平均 顯著升高。大量研究表明，肝損傷的生化指標中甘膽酸比谷丙轉氨酶，膽紅素等傳統的肝功 能檢驗指標更敏感。甘膽酸結合其他指標的分析可以為肝臟疾病的診斷、治療和預后分析 提供更多的依據。此外，甘膽酸水平也是多種膽道系統疾病、妊娠期肝內膽汁淤積癥及酒精 性肝損傷等的重要診斷依據。因此，測定血清甘膽酸是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循 環功能的敏感指標之一。 目前，體外定量測定甘膽酸主要是使用放射免疫分析法（RIA)，化學發光免疫分析 法（CLIA)等。放射免疫分析法由于需要專門的放免實驗室及設施，普通實驗室難以開展， 另外還會對操作人員的健康產生一定危害，目前已很少使用?；瘜W發光法靈敏度高，但是測 定速度較慢，且專用的化學發光檢測儀器昂貴，不利于基層開展。 目前本領域需要制備特異性強、靈敏度高的抗甘膽酸特異性抗體，并用該抗體開 發出快速、準確、高效、簡便的甘膽酸檢測試劑，而時間分辨免疫層析測試條，以其檢測速度 快、操作簡單、靈敏度高等特點，已得到越來越多的關注。
技術實現思路
： 為了解決現有甘膽酸臨床診斷的不足，本專利技術的目的是提供一種快速、高效、簡 便、準確檢測待測樣本中甘膽酸含量的時間分辨免疫層析測試條及其制備方法。 本專利技術還提供一種新的甘膽酸免疫原合成方法，用該方法合成的甘膽酸免疫原免 疫小鼠獲取特異性和親和力高的單克隆抗體，以及使用所獲得的單克隆抗體的時間分辨層 析測試條。 具體而言，本專利技術涉及一種甘膽酸半抗原，其結構式如式1， 123456 2 其中R為一（CH2)n-，η為2-8的任意整數，載體蛋白為牛血清白蛋白或者人血 清白蛋白。 3 此外，本專利技術還涉及由上述甘膽酸半抗原制備的抗體?？梢允嵌嗫寺】贵w，也可以 是單克隆抗體，尤其是由所述半抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。 4 再次，本專利技術還涉及一種檢測甘膽酸的測試條，包括： 5 底板，樣品墊，結合物釋放墊，反應膜，吸水紙； 6 其中在背板上依次放置樣品墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水紙，并且樣品墊與結 合物釋放墊的一側有部分重疊，但樣品墊與反應膜不重疊；結合物釋放墊另一側與反應膜 的一側部分重疊，但結合物釋放墊與吸水紙不重疊；反應膜的另一側與吸水紙部分重疊； 并且在反應膜上從與結合物釋放墊部分重疊一側至與吸水紙部分重疊一側依次劃有結核 抗原檢測線和質控線，并且檢測線和質控線均不與結合物釋放墊和吸水紙重疊； 并且其中與抗甘膽酸特異性單克隆抗體偶聯的時間分辨熒光納米粒子位于結合 物釋放墊中。反應膜上的檢測線為卵清蛋白、血清白蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白與甘膽 酸衍生物偶聯物，上述的甘膽酸衍生物如下式2所示， 其中R為一（CH2)n -，η為2-8的任意整數。 在所述測試條中，所述抗甘膽酸的特異性抗體可以是抗甘膽酸多克隆抗體或者單 克隆抗體，尤其由所述半抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。 在所述的測試條，所述乳膠粒子外面包裹氨基葡萄糖凝膠層，內部含有鑭系元素。 鑭系元素包括釤、銪、鉞、或其螯合物。 在所述的測試條，所述反應膜為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或者尼龍膜，尤其是 硝酸纖維素膜。 本專利技術所述的測試條適用的生物樣品為血漿、血清或者尿液。 前述甘膽酸免疫檢測試劑可以用于檢測待測樣本中甘膽酸的含量，所述的待測樣 本為血清、血漿或尿液。 本專利技術的主要優點包括：本專利技術制備的甘膽酸免疫原特異性強，暴露出甘膽酸 特有的與其它膽汁酸相區別的甘氨酸部分，制備出的抗甘膽酸單克隆抗體的特異性強、效 價高，與其他膽汁酸包括膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸等的交叉反應 < 20%，與其他常見藥物無交叉；而本專利技術制備的甘膽酸時間分辨免疫層析測試條，使用 了時間分辨熒光納米粒子，與普通熒光微球相比，大幅度消除了非特異性的結合，檢測信 號的信噪比顯著提高，與膠體金定量方法相比，消除了樣本和背景的干擾，結果更為準確， 具有檢測速度快、操作簡單、靈敏度高等特點，具有明顯的臨床檢驗優勢。【附圖說明】 圖1是說明本專利技術免疫層析測試條與對照化學發光試劑盒檢測結果的相互關系 的圖。 以下通過【具體實施方式】可以使本專利技術得到更清楚的說明，但本專利技術并不局限于以 下實施例。 實施例一：甘膽酸衍生物的制備及鑒定 以下實施例中所用的甘膽酸衍生物甘氨酸甲酯丁二酸酯化學結構式如式4所示： 該化合物的合成路線如下： 該衍生物具體的合成步驟如下： 化合物2的合成 (1)將50. 0g(122. 4mmol)化合物1膽酸溶于120mL甲醇，在4°C冰浴攪拌下通氯 化氫氣體3g，加熱回流20分鐘。 (2)將上述合成溶液冷卻，過濾，干燥，得42. 7g產品，白色固體，產率82. 6%。 化合物3的合成 (1)稱取38. lg(90. 2mmol)化合物2溶于400mL吡啶中，0 °C加入 21. 2g(lll. 2mmol)對甲苯磺酰氯（TsCl)，將此溶液在室溫下攪拌24h，得到合成溶液。 (2)將上述合成溶液加入水1000ml，用500ml乙酸乙酯萃取兩次，合并有機 相，5%鹽酸洗，水洗，干燥蒸干。柱色譜純化產品，得35. 3g產品，白色固體，產率67. 9%。 化合物4的合成 (1)稱取 18. 2g(31. 6mmol)化合物 3 和 6. 5g(100.0 mmol)疊氮鈉溶于 120mlDMF 中，60°C反應24小時，得到合成溶液。 (2)將上述合成溶液加入水1200ml，600ml乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯萃取 液，水洗，干燥，蒸干，柱色譜純化得11. 7g產品，白色固體，產率82. 9%。 化合物5的合成 (1)稱取10. 9g (24. 4mmol)化合物4,溶于50mL的甲醇，再加入50mL 2M的Κ0Η溶 液，加熱至完全溶解，冷卻，加入水500本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種甘膽酸半抗原，其結構式如式1，其中R為－(CH2)n－，n為2?8的任意整數，載體蛋白為牛血清白蛋白或者人血清白蛋白。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳慶全，馮婷婷，
申請(專利權)人：北京華信緣生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11
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