蛋白質和多肽的制備制造技術

一種制備期望的非拖絲蛋白的蛋白質或多肽的方法包含以下步驟：在合適的宿主中表達融合蛋白，獲得包含該融合蛋白的混合物，并任選地分離該融合蛋白。該融合蛋白包含衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段的至少一個溶解度增強部分。其還包含是期望的非拖絲蛋白的蛋白質或多肽的至少一個部分。每個溶解度增強部分與所述期望的蛋白質或多肽部分直接或間接連接。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及制備蛋白質和多肽，且更具體地涉及制備蜘蛛絲蛋白(拖絲蛋白)和其他非拖絲蛋白的蛋白質和多肽的領域。本專利技術提供了制備期望的蛋白質的方法，該期望的蛋白質可以是拖絲蛋白的蛋白質/多肽或非拖絲蛋白的蛋白質/多肽。還提供了用于制備期望的蛋白質和多肽的新型融合蛋白中間體以及編碼這些中間體的多核酸(polynucleic acid)分子。
技術介紹
由DNA制備蛋白質和多肽可在多種宿主中實現(xiàn)，但常見的問題是不溶性蛋白質/ 多肽聚集體的形成。這可嚴重地妨礙或甚至阻止功能性蛋白質/多肽的產生。針對該問題的一個解決方案是將期望的蛋白質或多肽與提供所需要的溶解度的蛋白質或多肽表達成融合蛋白。該融合蛋白可被裂解，從而分離期望的蛋白質。對于低溶解度蛋白質和多肽例如膜相關蛋白質和多肽，該問題通常加重。例如，肺表面活性蛋白C(SP-C ;表6)是由肺泡II型細胞產生的跨膜蛋白并且是防止肺泡在呼氣結束時萎陷所需要的表面活性物質的成分。新生兒經(jīng)常因表面活性物質的量不足而患呼吸窘迫。如今，用從動物的肺部提取的表面活性物質制劑治療該病癥。SP-C-33是SP-C的變體，其中跨膜螺旋中的殘基(通常主要是纈氨酸)被換成亮氨酸。SP-C-33保留了天然SP-C的功能，包括在膜中的適當插入，但是不太易于聚集且因此大量生產用于開發(fā)合成的表面活性物質制劑是可行的。因為迄今為止由DNA制備SP-C-33是不可能的，所以如今通過化學合成來制造。當由重組DNA表達時遇到困難的蛋白質和多肽的其他實例是A β -肽、IAPP、PrP、α-突觸核蛋白、降鈣素、催乳素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、ATF和肌動蛋白；SP_B、α -防衛(wèi)素和β -防衛(wèi)素；Α-Η類載脂蛋白；LL-37、SP-C, SP_C33Leu、Brichos, GFP、神經(jīng)絲抑蛋白；激素，包括EPO和GH，及生長因子包括IGF-I和IGF-II ;親和素和鏈霉親和素；和蛋白酶3C。專利技術概沭本專利技術的目的是提供用于制備蛋白質和多肽，且特別是非拖絲蛋白的蛋白質和多肽的新型手段和方法。提供用于制備在水中具有低的溶解度的蛋白質和多肽，且特別是非拖絲蛋白的蛋白質和多肽，例如當由重組DNA產生時易于聚集的蛋白質和多肽、膜蛋白和多肽及淀粉樣形態(tài)(amyloid-forming)的蛋白質和多肽的新型手段和方法也是本專利技術的目的。本專利技術的另一個目的是提供用于制備蛋白質或多肽藥物及藥靶的替代手段和方法。本專利技術的目的是提供用于制備含二硫鍵的蛋白質和多肽的新型手段和方法。提供用于制備載脂蛋白的新型手段和方法也是本專利技術的目的。為了這些目的和從以下說明書中將明顯的其他目的，本專利技術提供了根據(jù)第一方面的在生產期望的蛋白質或多肽的方法中有用的融合蛋白。融合蛋白本身可能是有用的，或其可被裂解以獲得分離形式的期望的蛋白質或多肽。根據(jù)本專利技術的融合蛋白包含(i)衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段的至少一個溶解度增強部分；和(ii)是期望的蛋白質或多肽的至少一個部分；其中每個溶解度增強部分與期望的蛋白質或多肽部分直接或間接連接。在融合蛋白的某些實施方式中，每個溶解度增強部分與SEQ ID NO 6具有至少80%的同一性或與SEQ ID NO 8具有至少50%的同一性。在融合蛋白的特定實施方式中，每個溶解度增強部分包含100至160個氨基酸殘基。在一個實施方式中，融合蛋白受制于如下條件當融合蛋白包含衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段的單一溶解度增強部分時，則期望的蛋白質或多肽是非拖絲蛋白的蛋白質或多肽。在優(yōu)選的實施方式中，期望的蛋白質或多肽是非拖絲蛋白的蛋白質或多肽。在一些實施方式中，期望的蛋白質或多肽與SEQ ID NO :6-10中的任何一個具有小于30%的同 一性。在某些實施方式中，融合蛋白包含至少兩個溶解度增強部分，所述溶解度增強部分的每一個衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段。在特定實施方式中，融合蛋白包含至少兩個連續(xù)的溶解度增強部分，所述溶解度增強部分的每一個衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段。在融合蛋白的一些實施方式中，至少一個溶解度增強部分與至少一個期望的蛋白質或多肽部分的氨基末端或羧基末端直接或間接連接。在特定實施方式中，至少一個溶解度增強部分構成融合蛋白的氨基末端和/或羧基末端。在一個實施方式中，融合蛋白還包含(iii)設置在至少一個期望的蛋白質或多肽部分與至少一個溶解度增強部分之間的至少一個裂解位點。在融合蛋白的某些實施方式中，期望的蛋白質或多肽衍生自海綿動物(sponges)、木節(jié)水母(comb jellies)、水母(jellyfishes)、珊瑚(corals)、海葵(anemones)、扁蟲(flatworms)、輪蟲(rotifers)、蟲回蟲(roundworms)、紐蟲(ribbon worms)、給(clams)、蝸牛(snails)、章魚(octopuses)、節(jié)肢蟲(segmented worm)、甲殼動物(crustaceans)、昆蟲、苔蘚動物(bryozoans)、腕足動物(brachiopods)、帚蟲類(phoronids)、海星(seastars)、海膽(sea urchins)、被囊動物(tunicates)、文昌魚(Iancelets)、包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。在特定實施方式中、期望的蛋白質或多肽衍生自軟體動物、昆蟲、包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。在另外的特定實施方式中，期望的蛋白質或多肽衍生自包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。在融合蛋白的一些實施方式中，期望的蛋白質或多肽選自由淀粉樣形態(tài)的蛋白質和多肽、含二硫鍵的蛋白質和多肽、載脂蛋白、膜蛋白和多肽、蛋白質和多肽藥物與藥靶、易于聚集的蛋白質和多肽、及蛋白酶組成的組。在融合蛋白的特定實施方式中，期望的蛋白質或多肽選自由以下組成的組Α β -肽、IAPP, PrP, α -突觸核蛋白、降鈣素、催乳素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、ATF和肌動蛋白；SP-B、a-防衛(wèi)素和β-防衛(wèi)素；Α_Η類載脂蛋白；LL_37、SP-C, SP-C33、SP-C33Leu、fcichos、GFP、神經(jīng)絲抑蛋白；激素，包括EPO和GH，及生長因子，包括IGF-I和IGF-II ;親和素和鏈霉親和素；和蛋白酶3C。融合蛋白的優(yōu)選實施方式選自由SEQ ID NO 26、28、30、34、37、39、42和47和與這些蛋白質中的任何一種具有至少80%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少95%的同一性的蛋白質組成的組。根據(jù)特定的方面，期望的蛋白質或多肽是拖絲蛋白的蛋白質或多肽。優(yōu)選的期望的拖絲蛋白的蛋白質包含70至300個氨基酸殘基的重復片段，該片段衍生自蜘蛛絲蛋白的重復片段；和70至120個氨基酸殘基的C端片段，該片段衍生自蜘蛛絲蛋白的C端片段，和任選地100至160個氨基酸殘基的N端片段，該片段衍生自蜘蛛絲蛋白的N端片段。另外優(yōu)選的期望拖絲蛋白的蛋白質選自由式REP-CT和NT-REP-CT定義的蛋白質的組，其中NT是具有100至160個氨基酸殘基的蛋白質片段，該片段是衍生自蜘蛛絲蛋白的N端片段；REP是具有70本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.03.18 EP 10156927.5;2010.04.21 SE PCT/SE2010/1.一種融合蛋白，包含 (i)衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段的至少一個溶解度增強部分；和 ( )是期望的非拖絲蛋白的蛋白質或多肽的至少一個部分， 其中每個溶解度增強部分與所述期望的蛋白質或多肽部分直接或間接連接。2.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中每個溶解度增強部分與SEQID NO 6具有至少80%的同一性或與SEQ ID NO 8具有至少50%的同一性。3.根據(jù)任一項前述權利要求所述的融合蛋白，其中每個溶解度增強部分包含100至160個氨基酸殘基。4.根據(jù)任一項前述權利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少兩個溶解度 增強部分，所述溶解度增強部分的每一個衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段。5.根據(jù)權利要求4所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少兩個連續(xù)的溶解度增強部分，所述溶解度增強部分的每一個衍生自蜘蛛絲蛋白的N端(NT)片段。6.根據(jù)任一項前述權利要求所述的融合蛋白，其中至少一個溶解度增強部分與至少一個期望的蛋白質或多肽部分的氨基末端或羧基末端直接或間接連接。7.根據(jù)權利要求6所述的融合蛋白，其中至少一個溶解度增強部分構成所述融合蛋白的氨基末端和/或羧基末端。8.根據(jù)任一項前述權利要求所述的融合蛋白，還包含 (iii)設置在至少一個期望的蛋白質或多肽部分與至少一個溶解度增強部分之間的至少一個裂解位點。9.根據(jù)任一項前述權利要求所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋白質或多肽與SEQIDNO 6-10中的任何一個具有小于30%的同一性。10.根據(jù)權利要求9所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋白質或多肽衍生自海綿動物、櫛水母、水母、珊瑚、海葵、扁蟲、輪蟲、蛔蟲、紐蟲、蛤、蝸牛、章魚、節(jié)肢蟲、甲殼動物、昆蟲、苔蘚動物、腕足動物、帚蟲類、海星、海膽、被囊動物、文昌魚、包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。11.根據(jù)權利要求10所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋白質或多肽衍生自軟體動物、昆蟲、包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。12.根據(jù)權利要求11所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋白質或多肽衍生自包括人類的脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌或病毒或是人工蛋白質或多肽。13.根據(jù)權利要求9-12中任一項所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋白質或多肽選自由淀粉樣形態(tài)的蛋白質和多肽、含二硫鍵的蛋白質和多肽、載脂蛋白、膜蛋白和多肽、蛋白質和多肽藥物及藥靶、易于聚集的蛋白質和多肽及蛋白酶組成的組。14.根據(jù)權利要求13所述的融合蛋白，其中所述期望的蛋...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：揚·約翰松，安娜·里辛，麥·赫德哈馬爾，謝斯廷·努德林，
申請(專利權)人：思百博技術股份公司，
類型：
國別省市：