針對NGF的適配體及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供具有結(jié)合NGF的活性的更高質(zhì)量的適配體。本發(fā)明專利技術(shù)提供一種結(jié)合NGF的適配體，所述適配體滿足下述(1)和(2)：(1)包含由UGAAARAAACC(SEQ?ID?NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ?ID?NO：65)所示的序列，和(2)具有不超過73的堿基長度。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及針對NGF的適配體，利用其的方法等。
技術(shù)介紹
神經(jīng)生長因子(NGF)是于1951年鑒定的第一個神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，并且是參與外周和中樞神經(jīng)元的發(fā)育和存活的重要的分泌性蛋白。其由118個氨基酸組成，分子量為13kD，并且在分子中的3個位置處具有S-S鍵。在該家族蛋白中有BDNF、NT-3和NT-4/5，它們在結(jié)構(gòu)上是非常保守的，并且通過非共價鍵形成同型二聚體。其具有面向3個不同方向的β折疊結(jié)構(gòu)，并且被認為在此部分中二聚化。其還具有在家族內(nèi)的同源性很低的4個環(huán)結(jié)構(gòu)(loop structure),并且這些部分被認為限定對受體的特異性。 作為NGF受體，已知有具有高親和性的酪氨酸激酶-型受體TrkA和具有低親和性的P75，后者屬于腫瘤壞死因子受體超家族。這些受體作為同型二聚體或異二聚體起作用，并且深入地參與在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持中。TrkA是單次(single-pass)跨膜受體并且在細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)。當結(jié)合NGF時，發(fā)生酪氨酸磷酸化，信號傳遞至下游，并促進細胞的分化和維持細胞的存活。作為TrkA的家族受體，已知有TrkB和TrkC。TrkB與BDNF和NT-4/5結(jié)合，TrkC與NT-3結(jié)合。p75與TrkA相比顯示較低的配體特異性，并且除了 NGF以外還與BDNF、NT_3和NT-4/5結(jié)合。盡管p75是單次跨膜受體，但其在細胞質(zhì)側(cè)沒有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。類似于TrkA，其不僅在神經(jīng)細胞中表達，而且在非神經(jīng)細胞中也表達。已知此受體參與促進細胞的分化和維持細胞的存活，以及涉及誘導凋亡和細胞遷移。晶體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明NGF同型二聚體以2 2結(jié)合TrkA且以2 I結(jié)合p75。NGF同型二聚體有時與TrkA和p75的異二聚體結(jié)合。NGF由施旺細胞(Schwann cell)、角化細胞(keratinized cell)、支氣管上皮細胞、成纖維細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、B淋巴細胞、角質(zhì)形成細胞、平滑肌細胞、腎小球細胞、骨骼肌細胞等產(chǎn)生。另一方面，已知TrkA在神經(jīng)細胞中，以及除神經(jīng)細胞以外在單核細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和肥大細胞中表達。類似地，p75在神經(jīng)細胞以及非神經(jīng)細胞中表達。眾所周知，NGF在神經(jīng)系統(tǒng)中具有關(guān)鍵性的作用。已經(jīng)闡明NGF具有維持膽堿能神經(jīng)元存活的作用并且被認為與阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease)具有某種聯(lián)系。另夕卜，由于NGF的腦內(nèi)給藥改善老年大鼠的記憶障礙,因而其也預(yù)期作為老年性癡呆(seniledementia)的治療藥物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NGF也作用于除神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織和細胞，并且參與機體的防御和組織修復(fù)過程。例如，已知將NGF施用于動物增加血管通透性，增強T細胞和B細胞的免疫應(yīng)答，誘導淋巴細胞分化，誘導肥大細胞生長，誘導肥大細胞釋放多種細胞因子等。NGF與炎癥有關(guān)，并且在患有炎性疾病的患者和炎性動物模型中已經(jīng)觀察到NGF的表達增加。其實例有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、銀屑病(psoriasis)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis)、哮喘(asthma)等。已經(jīng)報道類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液顯示較高的NGF濃度。另外，已經(jīng)報道類風濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠中NGF表達增加，和在關(guān)節(jié)炎模型小鼠中肥大細胞增多和NGF表達增加。NGF與疼痛密切相關(guān)。當NGF經(jīng)皮下施用于人時，深部疼痛諸如肌肉疼痛持續(xù)數(shù)天，并且發(fā)生注射部位的痛覺過敏。NGF敲除小鼠和TrkA敲除小鼠缺少無髓鞘神經(jīng)并且不會感覺到疼痛。當NGF以lmg/kg經(jīng)腹膜內(nèi)施用于成熟大鼠，發(fā)生針對有害熱刺激和機械性刺激的痛覺過敏。NGF轉(zhuǎn)基因小鼠顯示不伴有炎性病癥的痛覺過敏。另外，已知患有先天性無痛無汗癥(congenital insensitivity to pain with anhidrosis) (CIPA)的患者的TrkA基因具有異常，并且當NGF基因異常時痛覺減退。從上述來看，NGF抑制劑可以用作用于疼痛諸如傷害性疼痛(nociceptivepain)、炎性疼痛(inflammatory pain)、神經(jīng)性疼痛(neuropathic pain)、癌性疼痛(carcinomatous pain)、纖維肌痛(fibromyalgia pain)等的治療藥物。已經(jīng)報道了 NGF 抗體和NSAID的聯(lián)合療法(專利文件I)、NGF抗體和阿片樣物質(zhì)止痛劑的聯(lián)合療法(專利文件2)、使用NGF抗體治療術(shù)后疼痛的方法(專利文件3，專利文件4)、使用NGF抗體治療骨癌疼痛的方法(專利文件5)和使用NGF抗體治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法(專利文件6)。Tanezumab (PF-4383119或RN624)是針對NGF的抗體，其顯示在使用骨關(guān)節(jié)炎動物模型的疼痛模型試驗中有效，并且目前處于臨床試驗階段。盡管NGF和NGF受體是否存在抑制活性還未知，但有涉及結(jié)合NGF的天然RNA的報道(非專利文件I)。近年來，RNA適配體在藥劑、診斷劑和檢測藥物方面的應(yīng)用已經(jīng)得到了關(guān)注；一些RNA適配體已經(jīng)處于臨床研究階段或?qū)嶋H應(yīng)用中。在2004年12月，世界上首個RNA適配體藥物，Macugen在美國被批準為用于老年性黃斑變性(age-related maculardegeneration)的治療藥物。RNA適配體是指與祀分子諸如蛋白特異性結(jié)合的RNA,并且其可以使用SELEX(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment))方法(專利文件7-9)制備。在SELEX中，特異性結(jié)合祀分子的RNA選自具有約IO14種不同的核苷酸序列的RNA集合體(pool)。使用的RNA結(jié)構(gòu)具有約40個殘基的隨機序列，其側(cè)翼是引物序列。此RNA集合體允許與靶物質(zhì)裝配，并且使用濾器等僅收集與靶物質(zhì)結(jié)合的RNA。收集的RNA通過RT-PCR擴增，并且將其用作用于下一輪的模板。通過重復(fù)此操作約10次，可以獲得與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的RNA適配體。適配體藥物，如同抗體藥物，可以靶向細胞外因子。參考公共領(lǐng)域中的許多科學論文和其他參考材料，適配體藥物被認為在一些方面有可能超越抗體藥物。例如，適配體經(jīng)常顯示比抗體更高的結(jié)合力和更高的特異性。適配體不可能經(jīng)歷免疫排除，并且使用適配體不可能發(fā)生抗體特有的不良反應(yīng)，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。從遞送的角度看，由于適配體的大小為抗體的約1/10，藥物至目標部位的遞送較為容易。由于適配體通過化學合成制備，因此可以容易地作出各種改動，通過大規(guī)模制備降低成本成為可能。同時，適配體的血液半衰期通常比抗體的血液半衰期更短；然而，就毒性而言，此性質(zhì)有時是有利的。這些事實得出如下結(jié)論甚至在靶向同一種分子時，適配體藥物有可能優(yōu)于抗體藥物。本專利技術(shù)人已經(jīng)在PCT/JP09/066457中制備了結(jié)合NGF并且抑制NGF與NGF受體的結(jié)合的適配體，并且發(fā)現(xiàn)該適配體抑制NGF的神經(jīng)突伸長活性。專利文件10描述了針對NGF的適配體，其通過自動本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.03.24 JP 2010-0685461.結(jié)合NGF的適配體，所述適配體滿足下述(I)和(2): (1)包含由UGAAARMACC(SEQ ID NO :64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO 65)所示的序列，和 (2)具有不超過73的堿基長度。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適配體，所述適配體抑制NGF與NGF受體的結(jié)合。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的適配體，所述適配體抑制NGF的神經(jīng)突伸長活性或細胞增殖活性。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適配體，所述適配體具有不大于IOnM的50%抑制濃度。5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的適配體，所述適配體不結(jié)合NT-3。6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的適配體，所述適配體不抑制BDNF、NT-3或NT-4/5的細胞增殖活性。7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的適配體，所述適配體包含下述核苷酸序列(a)、(b)和(c)中的任一種 (a)選自SEQID NOs :1_54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶); (b)選自SEQID NOs :1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)，其中置換、缺失、插入或添加I至數(shù)個核苷酸；和 (c)與選自SEQID NOs :1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70%以上的同一'I生的核苷酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的適配體，其中至少一個核苷酸被修飾。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適配體，所述適配體用反向dT或聚乙二醇修飾。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的適配體，其中所述反向dT或聚乙二醇結(jié)合在所述適配體的5’端或3’端。11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項所述的適配體，其中在各個嘧啶核苷酸的核糖的2’-位處的羥基是相同的或不同的，并且是未取代的或被選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。12.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項所述的適配體，其中在各個嘌呤核苷酸的核糖的2’-位處的羥基是相同的或不同的，并且是未取代的或被選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。13.核酸，所述核酸包含選自SEQID NOs :1_54的核苷酸序列并且具有不超過73的堿基長度。14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸，其中至少一個核苷酸被修飾。15.根據(jù)權(quán)利要求14的核酸，所述核酸用反向dT或聚乙二醇修飾。16.根據(jù)權(quán)利要求15的核酸，其中所述反向dT或聚乙二醇結(jié)合在適配體的5’端或3’端。17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項所述的核酸，其中在各個嘧啶核苷酸的核糖的2’-位處的羥基是相同的或不同的，并且是未取代的或被選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。18.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項所述的核酸，其中在各個嘌呤核苷酸的核糖的2’-位處的羥基是相同的或不同的，并且是未取代的或被選自由氫原子、氟原子和甲氧基組成的組的原子或基團取代。19.一種添加疏水物質(zhì)的適配體,所述適配體結(jié)合NGF。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的適...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：中村義一，金玲，平松久尚，
申請(專利權(quán))人：力博美科股份有限公司，鹽野義制藥株式會社，
類型：
國別省市：