一種特異識別細菌脂多糖的廣譜核酸適配體及其定向篩選方法技術

本發明專利技術提供一條能識別多種不同革蘭氏陰性菌來源的脂多糖廣譜性核酸適配體。該核酸適配體是基于免標記靶標分子、固定化核酸文庫的capture?SELEX技術基礎上定向篩選獲得的。即以鼠傷寒沙門氏菌脂多糖為唯一靶標，利用生物素?親和素作用將隨機寡核苷酸文庫通過生物素化的短互補鏈固定在親和素包被的Fe

【技術實現步驟摘要】
一種特異識別細菌脂多糖的廣譜核酸適配體及其定向篩選方法
本專利技術涉及食品安全與檢測、臨床醫學等領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)定向篩選一條脂多糖的廣譜性核酸適配體，它能特異識別鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌等4種細菌來源的脂多糖，為該核酸適配體在食品、藥品及生物制品中脂多糖的分析檢測、分離富集和毒性中和等方面的應用提供科學依據和理論基礎。
技術介紹
脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，又名內毒素(Endotoxin)，是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分。它主要由LipidA，核心多糖和O-特異性多糖重復單元三部分組成，其中LipidA是脂多糖的活性和毒性中心，位于外模的內側，具有高度的保守型，而決定LPS抗原性的O-特異性多糖鏈位于外膜的外層，暴露于細胞表面，結構不穩定，核心多糖則位于兩者中間，起連接作用。不同細菌來源的脂多糖結構不盡相同，毒性也不同，但是均具有相似的LipidA結構。LPS在體內可通過細胞信號轉導系統激活單核巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞等，合成或釋放出多種細胞因子和炎癥介質，從而引起機體一系列的反應，如發燒、腹瀉、休克、敗血癥、多器官衰竭甚至死亡。當菌體溶解或被殺滅死亡后，脂多糖被大量釋放到周圍環境中，因此它廣泛存在于日常生活種的飲用水、食品、藥品及生物制品中，嚴重危害了產品質量和人民的健康安全。目前，傳統的內毒素檢測方法主要有家兔熱源檢查法、鱟試劑法(LAL法)等，但是該類方法主要是基于酶催化反應的，因此在實際樣品檢測中容易受到蛋白酶等酶的影響而導致結果不準確，同時檢測耗時長，靈敏度低，不能滿足快速靈敏的市場需求。另外，由于細菌死亡溶解導致LPS的釋放，其污染難以避免，尤其是生物制品和最終產品中。因此發展快速、高效、靈敏的脂多糖檢測方法具有重要的意義。近年來，一些基于特異性識別LPS分子的生物傳感器如蛋白生物傳感器(LBP結合蛋白、CD14、rFC)、多肽生物傳感器(PmB)、抗體生物傳感器等在脂多糖檢測方面得到了初步應用。這些檢測方法雖然提高了檢測的靈敏度，但是這些蛋白分子特異性不強，容易與其他分子結合，從而影響了檢測結果的準確性；多肽的設計和制備成本高，同時檢測過程較復雜；而抗體制備需要進行動物實驗，同樣存在時間長、成本高的缺點。核酸適配體是利用上世紀90年代初發展的一種新的組合化學技術——SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，指數富集的配體系統進化技術)技術通過孵育、分離、擴增等反復多輪篩選得到的一段具有特定復雜三維結構并能特異性結合靶標分子的單鏈DNA或RNA序列。作為一種新型的仿生識別分子，核酸適配體能選擇性地特異結合靶標分子。由于其具有靶分子范圍廣、可體外化學合成、穩定性好、制備及修飾方便、成本低等優點，近年來在疾病治療、醫療診斷、環境檢測和食品安全等方面的應用引起了廣泛的關注。經過近30年的發展，已開發了各種各樣的SELEX技術，如CE-SELEX、Magnetic-CELEX、GO-SELEX、PD-SELEX、Capture-SELEX、Cell-SELEX等，盡管利用這些SELEX技術篩選得到諸如有機染料、金屬離子、氨基酸、抗生素、蛋白質、細胞、致病菌等近600種核酸適配體，但是除了哌加他尼鈉(pegaptanibsodium)和凝血酶核酸適配體外，能實際應用和開發的核酸適配體并不多。這可能是與篩選過程的不確定性有一定的關系。目前大部分篩選技術都是建立在固定靶標的基礎上發展起來的，由于靶標的固定需要進行化學修飾從而改變了目標物質的天然結構，因此篩選到的適配體特異性不強、親和性不高，實際應用受限。而毛細管電泳-SELEX技術等(CE-SELEX)雖然使靶標和文庫均游離狀態，保持了靶標的天然結構，但是該方法僅適用于大分子的篩選，另外，大分子可能存在多個結合位點，因此難以篩選到特定結合位點的核酸適配體。Capture-SELEX技術是通過非共價平衡作用將寡核苷酸文庫固定到磁珠、瓊脂糖顆粒等基質上而發展的一種文庫固定、靶標游離的SELEX技術，雖然具有免標記、免固定的優點，彌補了CE-SELEX不能篩選小分子的不足，但是同樣存在著篩選的不確定性。因此，開發定向SELEX篩選技術具有廣闊的應用前景。本專利技術以鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體為唯一靶標，利用生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸文庫通過生物素化的短互補鏈固定在親和素包被的Fe3O4磁性納米顆粒上，經過孵育、分離、擴增、酶切制備單鏈、克隆測序等步驟進行篩選，當文庫富集到一定程度后，再加入沙門氏菌和大腸桿菌完整的活性菌作為定向分子進行定向篩選出特異性和廣譜性均較高的細菌脂多糖核酸適配體。這種篩選策略利用脂多糖的結構特點和Capture-SELEX技術的優勢，無需使用多靶標混篩選，就能篩選到能識別鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌等不同細菌來源的脂多糖核酸適配體，具有操作簡便、效果明顯、篩選成本低的優勢。所獲得的適配體具有穩定性高、合成方便、易標記功能基團和報告分子，能應用于飲用水、食品或臨床醫學等方面脂多糖的分析檢測、分離富集和毒性中和。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種細菌脂多糖廣譜性寡核苷酸適配體的定向篩選方法，它操作簡單、效果明顯。本專利技術的另一目的在于提供一條識別細菌脂多糖的廣譜性寡核苷酸適配體，為開發細菌脂多糖的新型分離富集或分析檢測技術奠定良好基礎。本專利技術方法基于靶標游離、文庫固定的Capture-SELEX篩選技術，利用生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸文庫通過生物素化的短互補鏈固定在親和素包被的Fe3O4磁性納米顆粒上，經過孵育、分離、擴增、酶切制備單鏈、克隆測序等步驟反復篩選，當與脂多糖親和性的文庫富集到一定程度后，再加入沙門氏菌和大腸桿菌完整的活性菌作為定向篩選分子進行定向篩選，經過共15輪的反復篩選最終獲得一條能識別四種脂多糖的廣譜性核酸適配體。本專利技術的優點：(1)與傳統的篩選技術相比，該定向策略操作簡單、效果顯著，同時無需使用多靶標混篩選，不僅降低了成本，還提高了篩選成功率；(2)適配體可在體外篩選，篩選周期短，穩定性高、合成方便、易標記功能基團和報告分子，可長期保存使用；(3)所獲得的核酸適配體能同時識別鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌等4種細菌來源的脂多糖，具有較好的廣譜性和特異性。附圖說明圖1是LPS廣譜核酸適配體的定向篩選流程圖。圖2是寡核苷酸適配體EA7的模擬二級結構圖。圖3是寡核苷酸適配體EA7的飽和結合曲線圖。圖4是寡核苷酸適配體EA7的特異性試驗結果。具體實施方式：以下結合說明書附圖和實施例對本專利技術作進一步的說明，但不是限制本專利技術。1、體外化學合成隨機單鏈寡核苷酸(ssDNA)文庫及引物(IDT公司合成)，具體序列如下：ssDNA文庫：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG-(40nt)-TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3′；(長度80bp,中間為40個堿基的隨機序列，兩端分別為20nt的固定序列，庫容量在1014以上。)上游引物P1：5′-ATAGGAGT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一條能識別鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌等不同細菌來源的脂多糖核酸適配體，其特征在于寡核苷酸適配子序列如序列表中序列1所示的序列。

【技術特征摘要】
1.一條能識別鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌等不同細菌來源的脂多糖核酸適配體，其特征在于寡核苷酸適配子序列如序列表中序列1所示的序列。2.制備如權利要求1所述的能特異識別細菌脂多糖的廣譜核酸適配體定向篩選方法，其特征在于基于免標記的Capture-SELEX技術篩選富集后，加入活菌作為定向篩選分子進行定向篩選。3.如權利要求1中所述的核酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王周平，葉華，段諾，吳世嘉，夏雨，馬小媛，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇,32