本發明專利技術公開了一種通過基因融合降低Vip3蛋白對轉基因植物毒性的方法，1）、將一個多肽（polypeptide）基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個氨基酸組成的連接肽連接；2）、融合基因在植物細胞表達的融合蛋白質不集中在植物的細胞膜上。Vip3蛋白為以下任意一種：為Bt營養期殺蟲蛋白Vip3類蛋白的任意一種；為SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列；為與SEQ?ID?NO：?1具有至少70%相似性的氨基酸序列。多肽（polypeptide）為綠色熒光蛋白GFP；連接肽為Gly-Asp-Pro-Thr。將本發明專利技術所得的融合基因轉入植物中，從而獲得轉基因抗蟲植物。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物基因工程領域，具體涉及ー種構建Vip3類蛋白融合基因的方法及其轉入植物中構建抗蟲轉基因植物的應用。
技術介紹
蘇云金芽孢桿菌Bt是世界上應用最廣泛的殺蟲微生物，它在生長過程中能產生一系列的殺蟲毒素，其中研究最為深入、應用最多的是其殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystal Poteins, ICPs)。然而，在實際應用中有些重要的農作物害蟲(如小地老虎、茶尺蠖)對ICPs并不十分敏感，并且由于Bt產品的不合理使用，已有小菜蛾等害蟲對Bt制劑產生了不同程度的抗性(Zhao et al. , 2003 ; Griffitts et al. , 2001 )。因此,尋■找具有與ICPs不同殺蟲作用方式的蛋白，對于擴大殺蟲譜、延緩害蟲抗藥性的產生具有重要的理論意義和實用價值。營養期殺蟲蛋白(VegetativeInsecticidal Protein, VIPs)是一種新型Bt 殺蟲蛋白，它是Bt從對數生長中期開始分泌、直至穩定前期達到最高峰的胞外毒素。VIPs主要分為Vipl、Vip2和Vip3三種，Vipl和Vip2構成ニ元毒素，對鞘翅目葉甲科昆蟲具有殺蟲特異性，而Vip3對鱗翅目害蟲有較廣譜的殺蟲活性(Schn印f et al.，1998)。Vip3與已知的ICPs沒有序列同源性和結構相似性(Estruch et al.，1996)，殺蟲機理也不盡相同。與ICPs蛋白晶體不同，Vip3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用。研究表明，其N端是一段信號肽序列，可以使Vip3蛋白識別并結合在敏感昆蟲中腸上皮細胞膜上，造成膜穿孔，通過誘發中腸細胞凋亡，最終導致昆蟲死亡(Lee et al.，2006)。Vip3和廣泛使用的ICPs類Cry蛋白無交互抗性。因此，Vip3蛋白作為新的殺蟲資源在研究和應用方面將具有巨大的潛力，可用于構建和研制高效、廣譜的殺蟲蛋白基因來進行抗性害蟲的有效防治。目前，Vip3轉基因 作物的研發和應用已成為新的研究熱點。美國先正達(Syngenta)公司在全球最早開展了 Vip3轉基因研究，已將Vip3成功地應用于轉基因殺蟲植物的構建，并在棉花和玉米中首先得到應用。2003年研制出成功表達Vip3毒蛋白的棉花品種C0T102(Artim, 2003) ;2007年培育出轉vip3a20的轉基因玉米品系MIR162。2010年，先正達公司研制的含Vip3蛋白的棉花和玉米獲得美國環境保護署的批準(Syngenta,2010)，可將其用于防治對Cry基因產生抗性的鱗翅目害蟲，極大地拓寬了 Bt轉基因作物的抗蟲譜。現在，美國已開始種植含有Vip3蛋白的棉花品種和玉米雜交種。在國家轉基因專項的資助下，我國也積極開展了對Vip3基因的研究與利用。浙江大學與山西省農業科學院棉花研究所等単位合作，利用國內獲得的新型Vip3基因及其改造成果，構建具有自主知識產權的重組vip3與cryIA融合基因從而獲得抗蟲轉基因植物，可望實現對棉花、玉米、水稻等主要作物鱗翅目害蟲廣譜高抗的育種目標。盡管如此，在轉基因作物構建的實際操作中，仍然存在一些急需解決的技術性問題。例如，研究人員發現単獨的vip3基因轉入植物后，所獲得的高表達Vip3蛋白的轉基因植株在生長上較遲緩，容易出現白化現象。這是由于在轉基因植物中直接表達Vip3蛋白后，該蛋白由于信號肽的分泌作用大量聚集并結合在植物細胞膜上并形成孔道，從而對植物細胞形成一定的損壞，影響其生長發育。這樣還導致的另ー后果是，轉基因植物的抗蟲性能也不高。所用參考文獻具體如下盧雄斌，龔祖壩(1998)植物轉基因方法及進展。生命科學3:125-131。劉凡，王國英，曹鳴慶(2003)農桿菌介導的植物原味轉基因方法研究進展。分子植物育種1:108-116。Artim L (2003) Petition 03 - 155 - Olp for the determination ofnon_reguJ_ated status: Lepidopteran insect protected Vip3 cotton transformationevent Cotl02 (抗鱗翅目昆蟲的Vip3轉基因棉Cotl02)。Estruch J, Warren G，Mullins M，Nye G，Craig JK (1996) Vip3, a novelBacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum ofactivities agrainst lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci U S A93: 5389 -5394. Vip3 (一種對鱗翅目昆蟲有廣譜抗性的新型蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白；美國科學院院刊 93: 5389 - 5394. Vip3)。Griffitts SJj Whitacre LJj Stevens ED, Aroian VR (2001) Bt toxinresistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme. Science 293:860-864 (由于缺失推定的糖修飾酶而產生的Bt毒素抗性；科學293: 860-864)。Lee KMj Miles P，Chen JS (2006) Brush border membrane bindingproperties of Bacillus thuringiensis Vip3 toxin to Heliothis virescens andHelicoverpa zea midguts. Biochem Bioph Res Co 339: 1043-1047 (蘇云金芽抱桿菌Vip3毒素對煙蚜夜蛾和谷實夜蛾`的刷狀緣膜受體結合性質；生化和生理研究通信339:1043-1047)。Schnepf E, Crickmore N，Van Rie J, Lereclus D, Baum J (1998) Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mo_l Biol Rev 62:775 - 806 (蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲晶體蛋白；微生物分子生物學研究62: 775 - 806)。Syngenta. EPA approves Syngenta’s VipCot cotton for natural refuge[EB/OL]. [2010-06-02] http://news, agropages. com/News/NewsDetai1---2482. htm，先正達(EPA通過先正達的VipCot棉用于自然庇護)。Syngenta. USDA deregulates breakthrough Syngenta Seeds corn trait. [EB/OL]. [2010-04-22] http://news, agropages. com/News/NewsD本文檔來自技高網...
【技術保護點】
通過基因融合降低Vip3蛋白對轉基因植物毒性的方法，其特征是：1）、將一個多肽（polypeptide）基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個氨基酸組成的連接肽連接；2）、融合基因在植物細胞表達的融合蛋白質不集中在植物的細胞膜上。
【技術特征摘要】
1.通過基因融合降低Vip3蛋白對轉基因植物毒性的方法，其特征是 1)、將一個多肽(polypeptide)基因的C端與基因vip3的N端直接相連；中間加以4個氨基酸組成的連接肽連接； 2 )、融合基因在植物細胞表達的融合蛋白質不集中在植物的細胞膜上。2.根據權利要求1所述的通過基因融合降低Vip3蛋白對轉基因植物毒性的方法，其特征是 所述Vip3蛋白為以下任意一種 為Bt營養期殺蟲蛋白Vip3類蛋白的任意一種； 為SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列； 為與SEQ ID NO:1具有至少70%相似性的氨基酸序列。3.根據權利要求2所述的通過基因融合降低Vip3蛋白對轉基因植物毒性的方法，其特征是 所述多肽(polypeptide)為綠色突光蛋白GFP ； 所述綠色熒光蛋白GFP為SEQ ID NO...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈志成，李京，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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