一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT制造技術

本發明專利技術的目的是提供一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT，可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母MIG1基因，用于敲除該酵母MIG1基因，獲得乳糖酶基因表達葡萄糖解阻遏菌株。可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母MIG1基因，用于敲除該酵母MIG1基因，獲得乳糖酶基因表達葡萄糖解阻遏菌株，能夠使許多蛋白基因的表達都會受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情況下有關蛋白質或酶產量會大幅度提高，特別是乳糖酶，可以利用高產乳糖酶酵母菌通過發酵生產乳糖酶，降低乳糖酶生產成本和應用乳糖酶的費用，提高含乳糖牛奶和奶制品處理效果，對增加人類食用牛奶和奶制品的營養，增強身體健康具有重要的實際意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術公開一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，屬于生物

技術介紹
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1. 23)，通常稱為乳糖酶，可催化牛奶和奶制品中乳糖水解產生葡萄糖及半乳糖，并且具有半乳糖苷轉移作用。乳糖酶在食品、醫藥、能源工業和畜牧業等領域的廣泛應用，因而受到越來越多的關注。通過牛奶和奶制品中乳糖的水解增加這些食品的營養價值，解決乳糖不耐癥食用牛奶和奶制品出現的問題，同時產乳糖酶的微生物可以用于處理乳清廢水，減少環境污染。許多細菌、絲狀真菌和酵母菌可以產生乳糖酶，其中克魯氏酵母菌如馬克斯克魯氏酵母(Jluyveromyces marxianus),乳酸克魯氏酵母{Kluyveromyces lac ti51)和極地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17_I菌株產生的乳糖酶受到廣泛重視。尤其馬克斯克魯氏酵母具有很強的同化乳糖和菊粉的能力、生長速率極快、代時短、生長時耐高溫、具有很強的分泌胞外產物的能力和是被美國食品藥物局確認為最安全的微生物，而在許多方面得到了廣泛應用。但是所有產乳糖酶的微生物乳糖酶基因表達和合成乳糖酶時會受到培養基中的葡萄糖嚴重阻遏，由于工業用培養基和含乳糖培養基中存在有葡萄糖，所以葡萄糖阻遏會嚴重影響有關微生物的乳糖酶產量。在葡萄糖阻遏過程中一種叫做Migl蛋白起非常重要的作用，這種蛋白是一種帶有C2H2的鋅指蛋白，能結合在受葡萄糖阻遏的各種基因啟動子上，被結合的基因啟動子必須含有(G/C) (C/T)GGGG序列，在該序列的5端還得有富含AT的區域(AT_rich region)。現在發現Migl蛋白是細胞中具有廣泛調控作用的一種蛋白質，只要這些蛋白基因啟動子含有(G/C) (C/T)GGGG序列，這些蛋白基因的表達都會受到Migl蛋白的調控作用。所以該細胞中基因被敲除后，許多蛋白基因的表達都會受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情況下有關蛋白質或酶產量會大幅度提高。這樣構建合適的敲除載體，敲除馬克斯克魯氏酵母#/似基因，對于提高該酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生產實際意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母#/似基因，用于敲除該酵母基因，獲得乳糖酶基因表達葡萄糖解阻遏菌株。本專利技術的技術解決方案如下構建了可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母基因的敲除載體PMD19-HPT，攜帶有潮霉素磷酸轉移酶基因G7/T) 、用于同源重組的馬克斯克魯氏酵母基因啟動子序列和終止子序列和用于刪除逆Γ基因的Loxp片段(5’ -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3’)，在逆Γ基因表達框上下游各加入一個LoxP位點，并使二者同向，可以利用Cre重組酶將///T基因表達框刪除。在轉化敲除載體進入產乳糖酶的馬克斯克魯氏酵母細胞之前，用DNA限制性內切酶通ο 酶切質粒？1 19-即1'，獲得#見7基因啟動子片段-///T基因-#Λ 7基因終止子片段；轉化該片段到產乳糖酶的馬克斯克魯氏酵母細胞后，通過同源重組插入到正常的#/似基因中，利用基因取代基因ORF框，并可以穩定遺傳；獲得轉化子之后，把質粒PKlNatCre (攜帶有酶切Loxp片段的酶基因)轉化到轉化子中，表達后刪除規T基因，獲得無規T基因和MIGl基因的敲除菌株。本專利技術公開的一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，其堿基序列見如SEQ No.1所示。該載體大小為4137 bp。本專利技術提供的一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT制備方法如下 (I) PCR產物的擴增 MIGl基因的啟動子用5'端帶有ZAoI酶切位點的引物Hl和與克隆基因的特殊引物H3有共同序列的引物H2以尤marxianus的基因組DNA為模板進行PCR擴增，引物Hl和H2是根據尤基因序列設計的。引物Η3和Η4是根據質粒pCAMBIA 1381上規T基因序列設計的，利用這對引物通過PCR技術擴增規T基因(1026 bp)部分。MIGl基因的終止子由引物H5和H6以尤marxianus的基因組DNA為模板進行PCR擴增得到，弓丨物H6的5'端帶有XhoI酶切位點，引物H5和克隆逆Γ基因的特殊弓丨物H4有共同序列，弓I物H5和H6也是根據尤marxianus MIGl基因設計的。PCR擴增體系本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT，堿基序列見如SEQ?No.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，堿基序列見如SEQ No.1所示。2.權利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT制備方法，包括以下步驟 將擴增的PCR產物與載體pMD19-T Simple的連接；連接產物pMD19/HPT轉化E. ColiDm α感受態細胞； 質粒的提取、酶切及回收用于轉化酵母的線性DNA片段 利用質粒提取試劑盒提取質粒，質粒提取過程按照試劑盒說明進行；用％01酶切PMD19/HPT 質粒；37°C酶切 4 h 后，加入 2. O μ ΙΟX loading buffer 終止反應，并用 O. 8%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段； 轉化與篩選 (1)取80.O μ L的尤marXianus感受態細胞,加入濃縮并除...

【專利技術屬性】
技術研發人員：池振明，池哲，周海翔，徐金利，李慧娟，
申請(專利權)人：吉林巨潤生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：