一種基因定向克隆用TC載體及其制備和使用方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基因定向克隆用TC載體及其制備和使用方法，該載體兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。其制備方法包括a、填充序列的引物設(shè)計(jì)，由此得到引物1和引物2；b、在引物1和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列；c、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，從而形成前TC載體；d、內(nèi)切酶酶切該前TC載體并回收載體片段就可得到TC載體。其使用方法包括a、制備TC載體；b、設(shè)計(jì)一對(duì)待定向克隆基因的PCR引物；c、用這對(duì)引物和Taq酶擴(kuò)增待定向克隆基因并將產(chǎn)物連接于TC載體即可獲得定向克隆重組載體。本發(fā)明專利技術(shù)提高了從通用目的載體出發(fā)進(jìn)行的重組載體的構(gòu)建的工作效率，可減低實(shí)驗(yàn)成本。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種便于基因定向克隆的基因工程載體TC載體及其制備以及基因定向克隆的方法。
技術(shù)介紹
目前定向克隆技術(shù)主要有以下幾種方法(I)通過(guò)一種限制性核酸內(nèi)切酶消化載體，也用這種酶(或同尾酶)消化外源基因片段，然后將載體與外源基因片段通過(guò)T4 DNA連接酶催化連接，重組克隆包含方向不定(兩種方向)的外源基因片段。借助于限制性核酸內(nèi)切酶消化或其他方法從無(wú)定向克隆中篩選外源片段方向符合目的要求的克隆。這種方法缺點(diǎn)是載體兩個(gè)末端自我連接嚴(yán)重，后期篩選過(guò)程工作量大，并且存在較大不確定性，很可 能會(huì)得不到所需方向克隆；(2)通過(guò)兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶消化載體，也用這兩種酶消化外源基因片段，然后將載體與外源基因片段通過(guò)T4 DNA連接酶催化連接，重組載體即為定向克隆。該方法缺點(diǎn)是步驟繁瑣，工作量大，有時(shí)會(huì)很難找到合適的限性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)而確定實(shí)驗(yàn)方案；(3)在(I)的基礎(chǔ)上，增加外源基因片段與載體之間連接處的特殊序列，使正反向克隆中某向克隆具有或不具有某稀有限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別、切割位點(diǎn)，因而可以借助于該稀有限制性核酸內(nèi)切酶篩選方向克隆的篩選。這種改進(jìn)只是在一定程度上減少了( I)方法后期篩選工作量，而對(duì)其他缺點(diǎn)(存在較大不確定性，很可能會(huì)得不到所需方向克隆)無(wú)任何改進(jìn)。總之，現(xiàn)有技術(shù)存在步驟繁瑣、結(jié)果不確定或者難于制定實(shí)驗(yàn)方案等缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提出一種基因定向克隆的載體(可以為質(zhì)粒、噬菌體、病毒及其衍生載體等)及其制備和使用方法，從而大大方便外源基因片段定向克隆于目標(biāo)載體(如細(xì)菌、酵母、植物以及動(dòng)物表達(dá)載體等)，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本專利技術(shù)先將目的載體制備成具有“載體的兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基”特征的TC載體，然后只要把目的基因按照本專利技術(shù)所提出的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，即可將該擴(kuò)增產(chǎn)物直接定向連接于TC載體。對(duì)于從通用目的載體出發(fā)進(jìn)行的重組載體的構(gòu)建工作而言，該方法由于減少了操作步驟和實(shí)驗(yàn)試劑的消耗，使效率得到提高的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)成本也大大降低。本專利技術(shù)所提供的基因定向克隆用的TC載體是 在該線狀載體的兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基(稱之為“TC載體”)。本專利技術(shù)所提供的TC載體的制備方法，它包括以下步驟 a、填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一段序列已知DNA序列，該DNA片段長(zhǎng)度范圍100 2000bp (該DNA頻段用作目標(biāo)載體改造的“填充序列”，所存在于的載體稱為供體載體)，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與供體載體模板具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)各有一個(gè)I I或各有一個(gè)EamW^1、Mbo W、Hph1.Bmr l.Hpy AV和必￠/ I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ; b、在引物I和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列； C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，形成前TC載體(TC載體的前體)。由于引物I和引物2兩端的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的簡(jiǎn)并堿基經(jīng)過(guò)選擇，使之被克隆于目標(biāo)載體形成前TC載體后，用與a)相應(yīng)的I或者fe 1105 I,Mbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和必￠/ I中的一種酶切該前TC載體，所得到的載體片段即為符合TC載體特征的載體分子兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。—種基因定向克隆用TC載體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 a、填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長(zhǎng)度范圍100 2000bp (該DNA片段用作改造目標(biāo)載體的“填充序列”，該DNA片段序列所存在的載體稱為供體載體。);針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，該引物一方面與作為模板的供體載體具有特異結(jié)合的序列，同時(shí)各有一個(gè) Xcm I 或各有一個(gè)萬(wàn)<3 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ； b、在引物I和引物2引發(fā)下，以供體載體作DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即填充序列； C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，從而形成前TC載體，即TC載體的前體分子； 通過(guò)對(duì)引物I和引物2兩端的I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、處f AV和Ahd I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)的簡(jiǎn)并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或feM105 I, MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和處c/ I中的一種內(nèi)切酶酶切后，回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即權(quán)利要求1所述TC載體。本專利技術(shù)所提供的基于上述TC載體進(jìn)行的定向克隆基因的方法，它包括以下步驟 a、填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長(zhǎng)度范圍100 2000bp，用作改造目標(biāo)載體的“填充序列”。針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物一方面與目標(biāo)載體的DNA模板具有特異結(jié)合的構(gòu)造，同時(shí)兩條引物兩5’端各有一個(gè)Zos I或各有一個(gè)及 1105 UMo II,Hph1、Bmr1、Hpy AV和AM I中的一種的識(shí)別位點(diǎn)；由此得到引物I和引物2 ； b、用引物I和引物2對(duì)供體載體進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物充當(dāng)填充序列； C、將該填充序列克隆到目標(biāo)載體，形成前TC載體，即TC載體的前體分子；通過(guò)對(duì)引物I和引物2 兩端的 Jc I 或萬(wàn)<3 11051、Mbo II > Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種的識(shí)別位點(diǎn)的簡(jiǎn)并堿基的選擇，使得前TC載體經(jīng)Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,BmrI,Hpy AV和AM I中的一種內(nèi)切酶酶切后，再回收載體片段即可得到一個(gè)線性載體，其兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基，即權(quán)利要求1所述TC載體； d、設(shè)計(jì)待定向克隆基因的一對(duì)特異PCR引物，該引物對(duì)中一條引物5’端為C堿基，且另一條引物5’端為G或A或T堿基(正向還是反向引物5’端加C將決定DNA序列定向克隆的方向)； e、在d步所設(shè)計(jì)的引物引發(fā)下，用Taq酶(或其他與Taq酶具有相同末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶)PCR擴(kuò)增待克隆基因。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中，將有一個(gè)3’端突出一個(gè)A堿基、另一個(gè)3’端突出一個(gè)G堿基的產(chǎn)物，恰與上述TC載體兩3’末端匹配。將該擴(kuò)增產(chǎn)物和TC載體連接即可得到克隆方向確定的重組DNA分子。附圖說(shuō)明圖1是本專利技術(shù)基因定向克隆用TC載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是前TC載體結(jié)構(gòu)示意圖。 圖3是本專利技術(shù)原理圖。 圖4是本專利技術(shù)具體實(shí)施方式中的原核表達(dá)載體pET17b的質(zhì)粒圖譜。圖5是本專利技術(shù)具體實(shí)施方式中的細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA6/V5_His A質(zhì)粒圖譜。圖6是本專利技術(shù)具體實(shí)施方式中的植物表達(dá)載體PCAMBIA1391質(zhì)粒圖譜。圖7是本專利技術(shù)具體實(shí)施方式中定向克隆質(zhì)粒的鑒定圖譜。以下結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步的說(shuō)明。一、TC載體的制備 ① 填充序列的引物設(shè)計(jì) 選擇一本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基因定向克隆用TC載體，其特征在于，該載體兩個(gè)末端的3’端各突出一個(gè)堿基，其中一個(gè)3’端突出堿基為C堿基，另一個(gè)3’端突出堿基為T堿基。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李繼剛，李秀敏，楊忠祥，夏潔函，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河北大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：