本申請涉及蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域，具體公開了一種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VP1蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。本申請的重組質(zhì)?？梢詫崿F(xiàn)豬水泡病病毒VP1蛋白在昆蟲細胞外的分泌表達，從而直接從細胞培養(yǎng)液中提取豬水泡病病毒VP1蛋白，有效的提高了蛋白純化效率，降低了豬水泡病病毒VP1蛋白的制備成本，為基于豬水泡病病毒VP1蛋白的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
—種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達重組質(zhì)粒及其應用
本申請涉及蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域，特別涉及一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達的重組質(zhì)粒、該重組質(zhì)粒的構(gòu)建，以及采用該重組質(zhì)粒進行的豬水泡病病毒VPl蛋白的分泌表達。
技術(shù)介紹
豬水泡病(Swinevesicular disease, SVD)是由豬水泡病毒(swine vesiculardisease virus, SVDV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以口和蹄部產(chǎn)生水泡性損傷為特征，其臨床癥狀與口蹄疫、水泡性口炎和豬水泡疹相似，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。SVDV為小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬 (Enterovirus)。與人類柯薩奇病毒(Human coxsackievirus) B5型有非常相近的理化特性、生物學特性及血清學關(guān)系。目前，我國已經(jīng)消滅了豬水泡病，因此利用完整病毒粒子建立診斷方法存在潛在的散毒危險，在實踐中不可取。SVDV基因組為一單股正鏈RNA分子，全長為7400bp-7401bp， 基因組含一個大的開放閱讀框(0RF)，編碼一條由2185個氨基酸組成的多聚蛋白，經(jīng)翻譯后加工成為各種功能蛋白。SVDV結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(Pl區(qū))編碼病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白VPl (1D)、VP2 (1B)、VP3 (IC)和VP4 (IA),外殼蛋白VP1、VP2、和VP3包含中和性抗原位點。 非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(即P2和P3)編碼參與病毒復制的非結(jié)構(gòu)蛋白。對SVDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，病毒的中和性抗原位點在病毒的外殼蛋白上，其中VP3和VPl是誘導中和性抗體產(chǎn)生的主要抗原蛋白。進一步研究證實，VP3和VPl不僅為序列依賴性抗原多肽，而且還具有抗變性作用。有的研究者認為結(jié)構(gòu)蛋白VPl的87、88位殘基為一中和性抗原位點；有的認為VPl的I 40位氨基酸殘基為一中和性抗原位點；還有人認為VPl的95、98位氨基酸殘基為一中和性抗原位點。以上研究成果表明SVDV的抗原中和位點應集中在結(jié)構(gòu)蛋白VPl 上。昆蟲細胞表達系統(tǒng)是外源蛋白表達系統(tǒng)的一種，它以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體、昆蟲細胞為受體的表達系統(tǒng)。與細菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比，它具有以下特點安全性高，狀病毒對脊椎動物無感染性；能夠容納較大的外源基因，承載的外源片段可以大到38kb ;高效表達外源基因，與其它真核表達系統(tǒng)相比較，桿狀病毒表達系統(tǒng)最突出的特點就是可以便重組蛋白獲得高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50% ;具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有對蛋白質(zhì)完整的翻譯后加工能力，包括糖基化、磷酸化、航基化、信號膚切除及膚段的切割和分解等；重組蛋白具有完整的生物學功能，外源蛋白在細胞內(nèi)可以進行正確折疊、二硫鍵的搭配，表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。目如最常用的桿狀病毒表達系統(tǒng)是Bac_to_Bac系統(tǒng)，是Luckow等利用曬菌體復制子構(gòu)建的一種AcMNPV載體(苜猜銀蟻夜蛾多核型多角體病毒，autogra-phacalifornica multiple nuclear polyhedron-sisvirus),是由轉(zhuǎn)座子介導的桿狀病毒重組系統(tǒng)，即用外源基因替代多角體蛋白基因而構(gòu)建重組病毒，所用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號是單一或多個桿狀病毒的啟動子，其中最常用的是PPH啟動子和PlO啟動子。轉(zhuǎn)座過程是在大腸桿菌內(nèi)進行的，由供體質(zhì)粒、Bacmid穿梭載體和輔助質(zhì)粒三部分組成。Bacmid穿梭載體含有F因子復制子(可在大腸桿菌中復制)、卡那霉素抗性基因及Tn7轉(zhuǎn)座位點attTn7。在供體質(zhì)粒中，外源基因置于桿狀病毒啟動子之下，兩端分別為Tn7的左右端。以其轉(zhuǎn)化含Bacmid的大腸桿菌菌株 DHlOBac,由輔助質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生轉(zhuǎn)座，而將外源基因轉(zhuǎn)到Bacmid的attTn7位置。供體質(zhì)粒中的外源基因在轉(zhuǎn)座酶作用下，干擾LacZ的表達，所以含有重組質(zhì)粒(重組Bacmid) 的DHlOBac細菌在有IPTG、Χ-gal的培養(yǎng)板上形成白色菌落。從菌落培養(yǎng)物提取含外源基因的重組Bacmid DNA，用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞即可獲得重組病毒以進行外源基因的表達。昆蟲細胞系主要包括Sf9，Sf2I和High 5細胞，三種細胞均為規(guī)則的球形，Sf9細胞大小較規(guī)則，需要貼壁生辰，Sf21細胞大小不規(guī)則，需要貼壁生長，而High 5細胞大小不規(guī)則，可以進行懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)時附著比較松散。Sf9或Sf21因具有較高的轉(zhuǎn)染效率常用來制備重組病毒，也可以用來擴增重組蛋白5細胞轉(zhuǎn)染效率低，但可以利用其懸浮培養(yǎng)特性利用轉(zhuǎn)瓶大量擴增重組蛋白。目如利用桿狀病毒白表達系統(tǒng)表達外源蛋白，基本上都是細胞內(nèi)表達，表達載體不含有蛋白質(zhì)信號膚分泌信號，使得表達的重組蛋白無法分泌出細胞外，由于細胞自身蛋白含量高、成分復雜，給蛋白純化帶來困難，也增加了成本，也不利于重組蛋白的純化。原蜂毒溶血肽(bee promellitin)是蜜蜂毒腺分泌的毒液中的一種主要多肽毒素，由26個氨基酸組成，能與細胞膜結(jié)合改變其通透性，有溶血作用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本申請的目的是，提供一種新的適用于豬水泡病病毒VPl蛋白胞外分泌表達的重組質(zhì)粒。本申請的另一目的是，提供一種上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本申請的再一目的是，提供一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法。本申請的再一目的是，提供一種可以用于豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達的試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案本申請的一方面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號妝基因序列。進一步的，本申請的實施方式中，蜂毒信號肽基因序列含有Seq ID No. I所示序列。進一步的，表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因含有Seq ID No. 2所不序列。優(yōu)選的,本申請的重組質(zhì)粒以pFastBac I質(zhì)粒為載體。本申請的另一面公布了一種以pFastBac I質(zhì)粒為載體的豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其中包括，將表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列分別插入到PFastBac I質(zhì)粒的多克隆位點之間。本申請的實施方式中，表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因插入到pFastBacl質(zhì)粒的EcoR I和HindIII克隆位點之間；蜂毒信號肽基因序列插入到pFastBac I質(zhì)粒的BamHI和EcoR I克隆位點之間。本申請的再一面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達方法，包括以下步驟A.將本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DHlOBac中；B.提取轉(zhuǎn)座有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號妝基因序列的重組Bacmid質(zhì)粒；C.以步驟B提取的重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞獲得重組病毒；D.以步驟C獲得的重組病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)感染的昆蟲細胞，收獲細胞培養(yǎng)物的上清液，其中即含有豬水泡病病毒VPl蛋白。進一步的，本申請的實施方式中，昆蟲細胞優(yōu)選為sf9昆蟲細胞。更進一步的，上述步驟C中的轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法。本申請的再一面公布了一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達試劑盒，該試劑盒含有本申請?zhí)峁┑闹亟M質(zhì)粒，用以對豬水泡病病毒VPl蛋白進行胞外分泌本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種豬水泡病病毒VP1蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VP1蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種豬水泡病病毒VPl蛋白分泌表達重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒含有表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和蜂毒信號肽基因序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述蜂毒信號肽基因序列含有SeqID No. I所示序列。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因含有Seq ID No. 2所不序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒以PFastBacI質(zhì)粒為載體。5.—種權(quán)利要求4所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法包括，以PFastBac I質(zhì)粒為載體，將所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因和所述蜂毒信號肽基因序列分別插入到pFastBac I質(zhì)粒的多克隆位點之間。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述表達豬水泡病病毒VPl蛋白質(zhì)的基因插入到pFastBac I質(zhì)粒的EcoR I和Hind III克隆位點之...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曹琛福，李中圣，楊俊興，花群義，
申請(專利權(quán))人：深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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