一種改造已知載體多克隆位點的方法技術

本發明專利技術公開了一種改造已知載體多克隆位點的方法，即銜接子引物-PCR法，包括以下步驟：應用一對5’末端分別添加了多個限制性酶切位點的銜接子引物擴增任一物種中的已知DNA片段；用擴增片段兩端的限制性內切酶雙酶切，再用T4DNA連接酶將其連接至待改造載體的多克隆位點中；將連接產物轉化感受態大腸桿菌，挑取陽性克隆，提取質粒，酶切驗證改造的載體是否帶有新的酶切位點，保留正確的質粒載體。本發明專利技術能在已知載體多克隆位點中快速、便捷的添加新的酶切位點，以滿足具體實驗的需要，成本低廉，靈活性高，可應用于改造已知載體多克隆位點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于克隆
，具體涉及。
技術介紹
應用雙酶切對目標序列進行定向克隆是載體構建過程中最常用的方法。這一方法能極大地減少重組過程中的載體本身自連現象，提高構建效率。然而，在很多情況下，尤其是待克隆的目標DNA片段較長時,很難在已知載體的多克隆位點multiple cloning sites(簡稱MCS)中找到2個合適 的限制性內切酶酶切位點。另外，在雙酶切過程中，有些限制性內切酶之間的組合會嚴重降低彼此或其中之一的酶切效率，最終影響構建效率。因此，對載體的多克隆位點進行改造是分子生物學實驗中的常見情況，而這時便需要一種簡便、高效的多克隆位點改造方法。目前，對載體的多克隆位點進行改造的方法主要有3種:I)直接合成一段雙鏈DNA片段，雙酶切消化、回收后連接至原載體。由于合成的片段較短，該方法在膠回收過程中的得率通常較低。2)基于連接子linker技術的方法，合成兩個含所需酶切位點的互補的寡核苷酸序列，常規引物5’末端為羥基，用于連接子的引物5’末端需磷酸化，在PCR反應中通過退火獲得具有粘性末端的雙鏈的DNA片段，爾后不經過膠回收，直接與待改造的載體進行常規的酶切連接反應，完成原載體多克隆位點的改造。然而，由于不經過膠回收，導致原退火反應中的緩沖液殘留會影響下一步連接酶的連接效率。3)以另一載體的多克隆位點為來源，通過酶切、回收、再連接至待改造載體的多克隆位點中。然而，由于載體中的多克隆位點序列通常較短，為IOObp左右，使得酶切后的片段在膠回收中的得率通常不高，導致構建效率低。牛麟等提出在載體的MCS中插入一段238bp的輔助片段，爾后再用此MCS取代待被改造載體的MCS，最后再切除插入的輔助片段，完成載體的改造，但是該方法需要有原始的MCS模板序列，導致操作靈活性較低。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，以實現簡便快捷、可操作性強、效率高地改造已知載體多克隆位點。為了解決以上技術問題，本專利技術采用的技術方案如下: ，即銜接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步驟:步驟一，設計銜接子引物，用銜接子引物對目標片段進行擴增；步驟二，利用原載體已知酶切位點分別對擴增片段與原載體進行雙酶切，酶切后進行凝膠電泳，切膠后采用凝膠回收試劑盒回收目標片段，片段回收后通過T4 DNA連接酶進行連接反應；步驟三，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，驗證新引入的酶切位點的正確性。所述步驟一中設計銜接子引物的方法為:以實驗中現有的在動植物或昆蟲等物種基因組中擴增效率較好的引物對為基礎引物，避免基礎引物及其擴增序列中包含所要添加的酶切位點，擴增序列長度在IKb以內；在基礎引物對的前引物5’端依次添加酶切保護堿基、待改造載體多克隆位點中的某一酶切位點序列以及需添加的酶切位點序列，獲得銜接子iu引物序列；在基礎引物對的后引物5’端依次添加保護喊基、待改造載體多克隆位點中另一酶切位點序列以及需添加的酶切位點序列，獲得銜接子后引物序列；以銜接子前后引物對，擴增原基礎引物擴增的基因組DNA即模板DNA，獲得目標片段。所述銜接子引物-PCR法的反應體系為20 μ 1，包含2 μ I即IOOng模板DNA、2 μ I的IOX聚合酶緩沖液、0.4μ I的IOmM dNTP ；0.4μ I的10 μ M銜接子前后引物各，I μ I的高保真聚合酶、13.8 μ I的超純水；PCR方法的過程為:在94°C下預變性5分種；在94°C下變性30秒，在55°C下退火30秒，在72°C延伸I分種，循環35次；在72°C下延伸5分鐘；12°C保溫2小時；退火溫度根據所設計引物的基礎引物退火溫度作相應調整。所述步驟二中雙酶切體系中各試劑及用量分別為:擴增片段酶切體系為60ul，試劑包括20 μ I的銜接子引物擴增片段、6.0 μ I的IOX內切酶緩沖液、1.0 μ I的內切酶1、Ι.Ομ I的內切酶II和32 μ I的超純水；載體酶切體系為60ul，試劑包括15 μ I即600ng的載體、6.0μ I的IOX內切酶緩沖液、Ι.Ομ I的內切酶Ι、1.0μ I的內切酶II和37 μ I的超純水。采用1%瓊脂糖凝膠對所述酶切產物進行電泳檢測。對符合預期大小的原載體酶切片段、銜接子引物擴增產物的酶切片段，采用Promga公司的凝膠回收試劑盒進行回收。將各片段的回收產物采用Τ4 連接酶進行連接反應。所述步驟二中連接反應體系中各試劑及用量分別為:銜接子引物擴增片段酶切回收產物4.0 μ 1，原載體酶切回收產物2.0 μ 1，10ΧΤ4連接緩沖液1.0 μ 1，Τ4連接酶1.0 μ I和超純水2.0 μ I;連接條件為在溫度16°C下，連接8小時。所述步驟三中感受態細胞為:大腸桿菌菌株DH5 α或ToplO ;正確的重組質粒為在使用新的限制性內切酶雙酶切后，在凝膠電泳中出現2條電泳條帶，其中一條與原載體片段大小接近，另一條帶與原基礎引物擴增片段大小接近。連接產物大腸桿菌轉化與PCR陽性檢測。采用化學轉化法，將上述連接產物轉化至大腸桿菌菌株DH5 α或Τ0Ρ10感受態細胞中。轉化產物涂布于含有相應抗生素(與原載體中在細菌中篩選的抗生素相同)的LB平板上，37°C過夜培養。挑取平板中長出的單克隆菌落，進行單克隆PCR檢測，檢測用引物為原基礎引物。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳結果中出現與原基礎引物擴增片段大小相同的電泳條帶的單克隆為陽性克隆。對陽性克隆在含有相應抗生素的LB液體中進行擴繁培養，培養溫度37°C，時間12小時，采用Promga公司的質粒提取試劑盒提取培養產物中的質粒DNA (或載體DNA)。采用與單克隆PCR陽性檢測的相同方法對質粒DNA進行PCR檢測，保存正確的重組質粒DNA或改造后的載體DNA。對改造后的載體進行酶切驗證，確定新添加的酶切點有效。具體為:采用新添加的兩個限制性內切酶對改造后的載體進行雙酶切，酶切結果采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；正確的改造載體的酶切產物在凝膠電泳中應該出現2條電泳條帶，其中一條與原載體片段大小接近，另一條帶與原基礎引物擴增片段大小接近。本步驟中的雙酶切體系為20ul，包括如下組分:試劑I用量(μ I)—權利要求1.，即銜接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步驟: 步驟一，設計銜接子弓I物，用銜接子引物對目標片段進行擴增； 步驟二，利用原載體已知酶切位點分別對擴增片段與原載體進行雙酶切，酶切后進行凝膠電泳，切膠后采用凝膠回收試劑盒回收目標片段，片段回收后通過T4 DNA連接酶進行連接反應； 步驟三，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，驗證新引入的酶切位點的正確性。2.一種如權利要求1所述的改造已知載體多克隆位點的方法，其特征在于所述步驟一中設計銜接子引物的方法為:以實驗中現有的在動植物或昆蟲等物種基因組中擴增效率較好的引物對為基礎引物，避免基礎引物及其擴增序列中包含所要添加的酶切位點，擴增序列長度在IKb以內；在基礎引物對的前引物5’端依次添加酶切保護堿基、待改造載體多克隆位點中的某一酶切位點序列以及需添加的酶切位點序列，獲得銜接子前引物序列；在基礎引物對的后引物5’端依次添加保護堿基、待改造載體多克隆位點中另一酶切位點序列以及需添加的酶切本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種改造已知載體多克隆位點的方法，即銜接子引物?PCR法，其特征在于包括以下步驟：步驟一，設計銜接子引物，用銜接子引物對目標片段進行擴增；步驟二，利用原載體已知酶切位點分別對擴增片段與原載體進行雙酶切，酶切后進行凝膠電泳，切膠后采用凝膠回收試劑盒回收目標片段，片段回收后通過T4?DNA連接酶進行連接反應；步驟三，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，驗證新引入的酶切位點的正確性。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：左示敏，薛薌，李磊，張亞芳，潘學彪，陳宗祥，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：