腸道病毒71型感染性克隆及其構建方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種腸道病毒71型感染性克隆及其構建方法和應用。腸道病毒71型感染性克隆是以從腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA為模板，經RT-PCR擴增得到全基因組序列，再與載體連接，酶切篩選陽性克隆而獲得的。本發明專利技術僅用了一對引物，就擴增構建成功了感染性克隆，大大簡化了EV71的反向遺傳學操作步驟；獲得的感染性克隆及其序列信息，為EV71的致病機理研究提供了一個有效的平臺，可進行多個重要毒株或新毒株的全基因組序列獲得及病毒特性分析，同時為EV71的抗病毒藥物篩選平臺的建立及疫苗的評估提供了重要基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程領域，更具體地，本專利技術涉及腸道病毒71型感染性克隆及其構建方法和應用。
技術介紹
腸道病毒71型(EV71)病毒和柯薩奇病毒A16 (Coxsckie A16, CA16)是手足口病的主要病原，已在世界范圍內引起多次暴發與流行，主要發病者為嬰幼兒，嚴重危害兒童健康，CA16引起的癥狀輕微，而EV71的感染易引起無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等多種與神經系統相關的疾病，易發生死亡。腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。根據我國衛生部的最近數據，2010和2011兩個年度報道手足口病病例分別為1774669和1619706例，其中包括死亡病例905和509例。EV71抗體在成人血清中的陽性率達到65%以上，說明了這種病毒的廣泛傳播，每年春夏季溫度升高時都會進入感染高峰期，流行趨勢從散發逐漸趨于有小型聚集性爆發。然而，手足口病的相關科研工作比較薄弱，發達國家擁有較好的科研平臺，亞太地區為主要流行區域，卻對EV71的關注很少，至今在臨床上還沒有有效的疫苗和藥物，對EV71進行有效的預防和控制。利用反向遺傳學方法研究RNA病毒，在質粒水平上來操作、研究RNA病毒，獲得的病毒型表型穩定，操作方便，為EV71的深入研究提供了一個很好的基礎平臺。但由于EV71的全長基因組有約7.5 Kb的長度，因此，已報道的文章中多是通過分為多段PCR來測序或進一步構建感染性克隆，操作起來繁復較多，嚴重限制了對EV71的深入研究
技術實現思路
基于此，本專利技術提供了一種腸道病毒71型感染性克隆及其簡化的構建方法，以及構建得到的腸道病毒71型感染性克隆的應用。為實現上述專利技術目的，本專利技術采取了以下技術方案:一種腸道病毒71型感染性克隆的構建方法，包括以下步驟:(I)、以從腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA為模板，SEQ ID NO: 2為引物，反轉錄得到cDNA ;所述SZ2010-EV71的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；(2)、以步驟(I)得到的cDNA為模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，PCR擴增得到腸道病毒71型的全基因組序列；(3)、將步驟(2)得到的腸道病毒71型的全基因組序列與載體連接，酶切，篩選得到陽性克隆，即為腸道病毒71型的感染性克隆。在其中一個實施例中，步驟(I)中所述反轉錄的程序為:42°C—個小時，70°C 15分鐘。在其中一個實施例中，步驟⑵中所述PCR的程序為:94°C 30秒，55°C 30秒，72 °C 8分鐘，30個循環。在其中一個實施例中，步驟(3)中所述載體為T0P0-XL-PCR載體。本專利技術還提供了上述構建方法構建得到的腸道病毒71型感染性克隆。本專利技術還提供了腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71，其具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。本專利技術還提供了包含上述腸道病毒71型感染性克隆的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) T0P0-SZ2010-EV71/DH5 α。本專利技術還提供了上述腸道病毒71型感染性克隆在制備抗腸道病毒71型藥物或疫苗中的應用。本專利技術從深圳市2010年手足口病的一例死亡病例的病毒分離株出發，僅用了一對引物，就擴增構建成功了感染性克隆，大大簡化了 EV71的反向遺傳學操作步驟，為EV71重要毒株的序列獲得和分析、致病機理研究、藥物篩選提供方法提供了更簡便的平臺；在構建成功感染性克隆后，設計了八條引物對一個毒株的多個克隆進行了測序和序列比對，最終獲得該毒株的全基因組序列。從而從序列到方法上都填補了國內手足口病研究的空白。為EV71的致病機理研究提供了一個有效的平臺，可進行多個重要毒株或新毒株的全基因組序列獲得及病毒特性分析，同時為EV71的抗病毒藥物篩選平臺的建立及疫苗的評估提供了重要基礎。本專利技術的構建腸道病毒71型感染性克隆的方法，利用一對通用引物可擴增目前臨床樣本的絕大多數EV71病毒。附圖說明 圖1為來自genebank的現有EV71a、b、c三個亞型的代表毒株的基因組序列的比對圖；圖2為本專利技術實施例1中RT-PCR后，采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR結果進行檢測的圖譜；圖3為將圖2中得到的PCR產物連接到T0P0-XL-PCR載體中得到的感染性克隆；圖4為通過對20株代表毒株和本專利技術獲得的毒株分離株SZ2010-EV71VP1序列比對，繪制的系統進化樹；圖5為實施例1中構建得到的感染性克隆經恢復轉染細胞后的病變圖；其中A為陰性對照，B為恢復出的病毒；圖6為采用EV71VP1的抗體對圖5中的病變細胞進行標記后，病變細胞中病毒VPl蛋白的分布圖；其中C為陰性對照，D為恢復出的病毒。具體實施方案在以下實施例中，所用的EV71毒株分離株是分離自2010年深圳臨床檢測樣本中的一例死亡病例的糞便(深圳市兒童醫院防保科，樣本的采集方法、儲存、運送、處理均按照衛生部《手足口病預防控制指南(2008年版)》(6)執行)，經分析檢測后得到的陽性標本，命名為SZ2010-EV71，毒株保藏于深圳市疾病預防控制中心，本領域技術人員可以購買得到。該毒株分離株在序列上有潛在的致病序列或致病突變，病毒致細胞病變效率強，存在進一步的研究價值。以下實施例僅用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的包含范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1E71感染性克隆的構建包括以下步驟:1、擴增引物的設計與合成從genebank中選取EV71a, b, c三個亞型的代表毒株的基因組序列進行比對,如圖1所示，在病毒基因組3’和5’端都有30多個堿基的保守序列，因此，理論上來說，選取此段序列設計引物，可擴增EV71的絕大多數毒株的全基因組序列。本專利技術的專利技術人設計了一對可兼并大部分 EV71 的保守引物 EV71genomeS(SEQ ID NO:1)和 EV7IgenomeA(SEQ IDNO:2)，由Takara公司合成。其中:正向引物(上游引物)EV71genomeS5’端加入SnaBI酶切位點和T7啟動子序列，反向引物(下游引物)EV71gen0meA5’端加入30個T和MluI酶切位點，具體引物序列如下:EV71genomeS: 5，-GCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3’ (SEQ ID NO:1)EV71 genomeA: 5，-ACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTAC-3’ (SEQ ID NO:2)2、RT-PCR按照病毒RNA提取試劑盒(羅氏生物有限公司)提取死亡病例糞便樣本的RNA，反轉錄的引物為反向引物 EV 71genomeA(SEQ ID NO: 2)，按 Primescript RT-PCR Kit (TAKARA公司)說明書構建20 μ L反應體系，反轉錄程序為:42°C—個小時，70°C 15分鐘；PCR擴增的引物為正向引物EV71 genom本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種腸道病毒71型感染性克隆的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)、以從腸道病毒71型毒株SZ2010?EV71提取的RNA為模板，SEQ?ID?NO:2為引物，反轉錄得到cDNA；所述SZ2010?EV71的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:9所示；(2)、以步驟(1)得到的cDNA為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2為引物，PCR擴增得到腸道病毒71型的全基因組序列；(3)、將步驟(2)得到的腸道病毒71型的全基因組序列與載體連接，酶切，篩選得到陽性克隆，即為腸道病毒71型的感染性克隆。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅敏，張仁利，盧智剛，冼慧霞，
申請(專利權)人：深圳市疾病預防控制中心，
類型：發明
國別省市：