本發明專利技術揭示了一種WHV-S蛋白基因及基于該基因的零背景DNA克隆載體的構建方法，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列。本發明專利技術利用旱獺肝炎病毒（Woodchuckhepatitisvirus，WHV）表面S蛋白（WHV-S）對細菌的細胞毒性構建零背景（自殺）克隆載體，以降低DNA克隆時空載體發生率，節省克隆鑒定成本和時間，提高了工作效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于遺傳工程中DNA重組的載體
，尤其涉及一種WHV-S蛋白基因及基于該基因的零背景DNA克隆載體的構建方法。
技術介紹
目前，DNA分子克隆所用載體中，絕大部分采用的還是普通載體。1999年美國學者發現基因ccdB如果過量表達，具有殺傷大腸桿菌的作用。因而，近10多年來，形成了各種正性篩選克隆、表達載體，專利不下數十個，但是如果用Invitrogen公司的零背景(zerobackground)載體(含有自殺基因ccdB),不加外源DNA片段,直接用其pCR-1I blunt, zero載體自身連接，會發現有大量藍斑菌落產生，這說明與LacZ α融合的ccdB蛋白的表達水平不足以殺傷實驗室常用大腸桿菌菌株。
技術實現思路
鑒于上述現有技術存在的缺陷，本專利技術的目的是提出一種WHV-S蛋白基因及基于該基因的零背景DNA克隆載體的構建方法,利用旱獺肝炎病毒(Woodchuck hepatitisvirus, WHV)表面S蛋白(WHV-S)對細菌的細胞毒性構建零背景(自殺)克隆載體，以降低DNA克隆時空載體發生率，節省克隆鑒定成本和時間。本專利技術的目的將通過以下技術方案得以實現 一種WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以與藍斑相關蛋白LacZa基因融合表達。優選的，上述的一種WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因編碼的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列。優選的，上述的一種WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因編碼全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突變或雜交序列。優選的，上述的一種WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突變或雜交序列具有序列表中SEQ ID NO:3" SEQ ID NO:6 的氨基酸序列。優選的，上述的一種WHV-S蛋白基因，其中還包括一具有序列表中SEQ ID NO: 7的核昔酸序列的關鍵DNA序列，所述關鍵DNA序列編碼的關鍵融合蛋白具有序列表中SEQID NO:8的氨基酸序列。一種基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆載體，所述零背景DNA克隆載體包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。一種基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆載體的構建方法，包括以下步驟步驟I)將所述的WHV-S蛋白基因與目標克隆載體質粒進行擴增、酶切和拼接； 步驟2)將步驟I)所得產物轉化大腸桿菌感受態細胞； 步驟3)挑取步驟2)所得的大腸桿菌進行克隆，克隆鑒定后，擴增重組正確的質粒DNA ；步驟4)提取質粒DNA，進行DNA測序分析，得到的陽性重組質粒即為零背景DNA克隆載體質粒。優選的，上述的零背景DNA克隆載體的構建方法，其中所述步驟I)具體包括以下步驟 步驟a)將野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因進行PCR擴增，所述擴增的蛋白編碼DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端50個氨基酸殘基所對應的DNA序列，所述PCR產物DNA的3’ -端添加終止密碼，兩端添加與DNA克隆載體適配的內切酶位點； 步驟b)將目標克隆載體進行PCR擴增，打開LacZ α基因3’ -末端，去除LacZ α基因的固有終止密碼，兩端分別用內切酶處理； 步驟c)將步驟a)所得產物連接到步驟b)所得產物的LacZ α基因的下游，構成一環狀質粒載體。優選的，上述的零背景DNA克隆載體的構建方法，其中所述目標克隆載體是pUC系列的質粒載體。優選的，上述的零背景DNA克隆載體的構建方法，其中所述目標克隆載體為PUC18 或 pUC19。本專利技術的零背景DNA克隆載體的構建方法，適用于包括克隆載體和表達載體在內的所有類型的載體的制備，其中表達載體包括原核表達載體、真菌表達載體、昆蟲表達載體、哺乳類動物表達載體或植物表達載體。本專利技術的突出效果為本專利技術的零背景DNA克隆載體的構建方法提供了一種正性(Positive)篩選重組體的方法，降低DNA克隆時空載體發生率，節省克隆鑒定成本和時間同時，比現有技術中的“零背景載體”具有更少的藍斑。以下便結合實施例附圖，對本專利技術的具體實施方式作進一步的詳述，以使本專利技術技術方案更易于理解、掌握。附圖說明圖1是本專利技術WHV-S蛋白基因與LacZa基因形成融合蛋白的示意 圖2是本專利技術實施例WHV-S蛋白基因的序列放在克隆區或其下游，啟動子位于上游的示意圖。具體實施例方式下面通過具體實施例對本專利技術的方法進行說明，但本專利技術并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。本專利技術提供了一種WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以與藍斑相關蛋白LacZa基因融合表達，如圖1所示。本專利技術還提供了所述WHV-S蛋白基因編碼的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ IDNO:2的氨基酸序列。WHV-S蛋白具有較明顯的細胞毒性，屬首次披露。本專利技術還提供了所述WHV-S蛋白基因編碼全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突變或雜交序列，所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突變或雜交序列具有序列表中SEQ ID NO:SEQ ID NO:6的氨基酸序列，可以在其上游相關啟動子的作用下表達WHV-S蛋白(SEQ ID NO: 2)或其同源蛋白(SEQID NO: SEQ ID NO: 6)，使得含有空載體的細胞發生死亡。還包括一具有序列表中SEQ IDNO: 7的核昔酸序列的關鍵DNA序列，所述關鍵DNA序列編碼的關鍵融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列。 本專利技術還提供了一種零背景DNA克隆載體，包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。本專利技術還提供了一種零背景DNA克隆載體的構建方法，包含如下步驟 1)將野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因的DNA序列PCR擴增，擴增的蛋白編碼DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端146個氨基酸殘基(SEQ ID NO:9)對應的DNA序列(SEQ IDNO: 10)，或者最小為50個氨基酸殘基對應的DNA序列，在其PCR產物DNA的3’ -端添加終止密碼；兩端添加與載體適配的內切酶位點； 2)將目標克隆載體(如pUC18或pUC19)PCR擴增，打開LacZa基因3’-末端，得到在LacZa末端線性化的載體，去除LacZ α基因的固有終止密碼，兩端分別用合適的內切酶處理； 3)將步驟I)和步驟2)所得產物相互連接，將WHV-S蛋白基因順向插入LacZα基因的下游； 4)將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，不加IPTG鋪板； 5)挑取步驟4)所得大腸桿菌克隆，克隆鑒定后，擴增重組正確質粒DNA； 6)提取質粒DNA，行DNA測序分析，得到的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種WHV?S蛋白基因，其特征在于：所述WHV?S蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李萬波，
申請(專利權)人：盤古基因科技蘇州有限公司，姚卓，
類型：發明
國別省市：
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