雞pcdh1基因部分片段的克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備制造技術(shù)

發(fā)明專利技術(shù)涉及protocadherin1(pcdh1)基因的部分序列在制備多克隆抗體和表達(dá)檢測中的應(yīng)用，具體而言，是對雞pcdh1基因的部分序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，插入到表達(dá)載體，并通過在大腸桿菌E.coliBL21中原核表達(dá)和融合蛋白親和純化，把純化的蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化后通過足墊等部位多點(diǎn)注射免疫SD大鼠,快速地產(chǎn)生針對目的抗原的特異性抗體。利用該方法快速制作的免疫血清，對不同發(fā)育階段雞胚中的pcdh1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，說明利用本方法制作的針對pcdh1蛋白部分肽段的多抗有望成為pcdh1基因蛋白表達(dá)檢測的有效工具。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種多克隆抗體制作技術(shù)，具體而言，就是利用設(shè)計的特定引物，通過相應(yīng)手段原核表達(dá)和純化目的蛋白，免疫動物制作免疫血清，進(jìn)而通過實(shí)驗闡明本抗血清用作基因蛋白表達(dá)檢測的可行性。
技術(shù)介紹
原I丐粘蛋白(Protocadherins, pcdh)是一種帶有親同種抗原粘附活性的跨膜蛋白，是鈣粘蛋白超家族中最大的亞群。/7 *主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約有60多種在大腦中表達(dá)?，F(xiàn)有的研究表明對神經(jīng)元突觸的發(fā)育有直接的影響。pcdh分子不僅可以作為粘附分子加強(qiáng)神經(jīng)突觸的連接，而且還可以作為受體在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到一定作用。此外，/7 *參與細(xì)胞遷移和細(xì)胞分選，神經(jīng)元回路和神經(jīng)突觸的建立以及細(xì)胞存活和細(xì)胞生長抑制。一箜PCdh基因的突變已經(jīng)與一些人類疾病聯(lián)系在了一起。比如，功能的缺失會導(dǎo)致動脈管壁的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，通過啟動子的高度甲基化使沉默表達(dá)會導(dǎo)致17腫瘤抑制活性的消失，說明PCdhM的表達(dá)可以抑制食管癌的發(fā)生；臨床研究表明等位突變可導(dǎo)致隱形視網(wǎng)膜色素變性'pcdtm的突變或者缺失會造成女性患家族性的癲癇；Koppelman等發(fā)現(xiàn)是氣道高反應(yīng)的易感基因，又有研究表明I是引發(fā)哮喘的并且在呼吸道上皮組織表達(dá)的一個新的易感基因。雖然目前我們對Pci*的功能有了一定的了解，但是有些Pci*在胚胎發(fā)育及病理過程中的時空表達(dá)及作用機(jī)制仍然不清楚。本專利技術(shù)所述以雞源I (GeneBank收錄號NM_001045827)為研究對象，建立制備其多克隆抗體的方法以及制備雞源的多克隆抗體和用于其表達(dá)檢測，迄今未見相關(guān)報道。本專利技術(shù)目的在于，通 過克隆、異源表達(dá)和純化特定肽段的融合蛋白，作為抗原免疫動物，制作多克隆抗體，利用此抗體檢測雞I基因在各種生理病理條件下的表達(dá)，進(jìn)而提供一種的表達(dá)檢測試劑用于基礎(chǔ)及醫(yī)療實(shí)踐。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)首先根據(jù)雞基因(GeneBank收錄號NM_001045827)的序列，先用Globplot2.3軟件分析的跨膜區(qū),然后再用DNAStar引物設(shè)計軟件設(shè)計I膜內(nèi)區(qū)段引物: 上游引物 5’ -GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3, 下游引物 5’ -GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3> ； 上游引物和下游引物分別添加和及^RI酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。從一周左右的雞胚腦組織中提取總RNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增膜外目的片段。將目的片段連入表達(dá)載體，篩選陽性重組質(zhì)粒。本專利技術(shù)目的之一在于提供一種雞源I特異性多克隆抗體。本專利技術(shù)的目的之二在于提供制備該克隆抗體的方法。本專利技術(shù)的目的之三在于提供克隆表達(dá)該肽段的序列引物，該引物還可以用于RT-PCR來檢測該基因的mRNA表達(dá)水平。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案: 一種雞源特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將氨基酸序列的第33位到204位氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合。上述的特異性多克隆抗體是將第33位到204位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA序列構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-2TK中，得到重組質(zhì)粒pGEX-2TK-pcdhl01，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到可溶表達(dá)帶有雞源I第33位到204位氨基酸殘基的多妝融和蛋白。上述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。一種制備上述的雞源I特異性多克隆抗體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為: a.Mpcdhl氨基酸序列進(jìn)行了蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，其中第I到239位氨基酸為胞外段結(jié)構(gòu)； b.用PCR擴(kuò)增處于胞外段第33到204位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA，重組入pGEX_2TK中，構(gòu)建成 pGEX-2TK-pcdhl01 載體； c.將載體轉(zhuǎn)化到疋BL21(DE3)中，原核可溶表達(dá)表達(dá)得到包含目的DCFI多肽的可溶性融合蛋白； d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述制備的蛋白，按照多抗免疫方案進(jìn)行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。利用Western Blot技術(shù)對制備得到的多克隆抗體進(jìn)行特異性評測。同時利用制備的上述多克隆抗體能夠檢測到雞胚組織pcdhI蛋白的表達(dá)。制備的多克隆抗體也檢測到了的蛋白表達(dá)變化，說明制備的多克隆抗體可以用來檢測雞胚不同時期的表達(dá)水平。本專利技術(shù)為此提供了以下的生物學(xué)實(shí)驗: 1)pcdhI基因的RT-PCR檢測實(shí)驗； 2)Western blotting方法檢測雞胚組織中I的表達(dá)水平。本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，設(shè)計合成了克隆雞第33位到204位氨基酸殘基的引物，并且此引物可以用于RT-PCR檢測pcdh I基因的mRNA表達(dá)水平；制作了針對雞pcdhl蛋白的鼠源多克隆抗體,實(shí)驗證明此抗體可用于Western blot檢測的蛋白表達(dá)水平。附圖說明 圖1 pcdhl基因pcdh胤片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中: 泳道 M.DNA marker ； 泳道1.PcdhlQl PCR擴(kuò)增片斷；縮寫:bp, base pair。圖2重組表達(dá)載體的PCR及酶切檢測。其中: 泳道1.PCR擴(kuò)增pET32a-pcdhl01產(chǎn)生的目的片斷；泳道 2.Βαω I 和 &oR I 雙酶切 pET32a_pcdhl01 ；泳道 3.pET32a-pcdhl01 ； 泳道4.PCR擴(kuò)增pGEX-2TK-pcdhl01產(chǎn)生的目的片斷；泳道 5.Bam^ I 和 &oR I 雙酶切 pGEX_2TK-pcdhl01 ；泳道 6.pGEX-2TK-101 ；縮寫:bp, base pair ；M, DNA marker。圖3 GST-PCDH101融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測。其中: 泳道1.未誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21全蛋白； 泳道2.誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21全蛋白； 泳道3.未誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21裂解沉淀； 泳道4.誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21裂解沉淀； 泳道5.未誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21裂解上清； 泳道6.誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21裂解上清。圖4 SDS-PAGE分析(His)6-1Ol融合蛋白和純化蛋白。其中: 泳道1.未誘導(dǎo)的含pET32a-pcdhl01質(zhì)粒的BL21總蛋白； 泳道2.1PTG誘導(dǎo)的含pET32a-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21全蛋白； 泳道3.1PTG誘導(dǎo)的含pET32a-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21沉淀； 泳道4、5.1PTG誘導(dǎo)的含pET32a-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21上清； 泳道6.純化的(His)6-PCDHlOl融合蛋白。圖5 SDS-PAGE分析重組GST-PCDH101融合蛋白。其中: 泳道1.未誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒的大腸桿菌BL21全蛋白； 泳道2.1PTG未誘導(dǎo)的含pGEX-2TK-pcdhl01質(zhì)粒本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種雞pcdh1特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是包括如下步驟：(1)?根據(jù)雞pcdh1基因，設(shè)計并合成引物：?上游引物5’?GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT?3’，下游引物5’?GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA?3’；?通過RT?PCR擴(kuò)增雞pcdh1基因片段，其全長為516?bp；(2)?將步驟(1)獲得的pcdh1基因片段連入表達(dá)載體pGEX?2TK中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli?DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX?2TK?pcdh101；(3)?將步驟(2)獲得的表達(dá)雞pcdh1基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli?BL21中，用LB液體培養(yǎng)基，21℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，誘導(dǎo)；(4)?將誘導(dǎo)后的菌體在4℃下離心收集，用去離子水和PBS分別清洗，加入溶菌酶并超聲裂解破碎，離心破碎后的菌液，收集上清；(5)?使用Glutathione?Sepharose?4B親和層析柱純化融合蛋白；(6)?把純化后的融合蛋白作為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李永海，李萌，陳國榮，王琳，陳紅麗，劉涌濤，趙興華，李超英，豐慧根，林俊堂，
申請(專利權(quán))人：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：