一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。它是將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動(dòng)子序列與表達(dá)載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中，而得到具有雙啟動(dòng)子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli?BL21(DE3)/azoR，所述的NADH-偶氮還原酶基因?yàn)镚enebank登錄號(hào)為EF198254所示的核苷酸序列，所述的NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子為Genebank登錄號(hào)為EF647586所示的核苷酸序列。該基因工程菌E.coli?BL21(DE3)/azoR可以在更廣溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)偶氮染料的脫色，具有更強(qiáng)的脫色活性和長(zhǎng)期的存活能力，在染料廢水處理方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
:近年來(lái)，隨著偶氮染料的廣泛使用，其合成及降解過(guò)程帶來(lái)“三致”作用引起的環(huán)境污染問(wèn)題也日漸嚴(yán)重，有關(guān)偶氮染料降解的研究也越來(lái)越引起人們的重視。自20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌可以還原降解偶氮染料以來(lái)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌具有此功能，其中以假單胞菌、芽孢桿菌和腸道桿菌數(shù)量最多。細(xì)菌對(duì)偶氮染料的還原降解主要是通過(guò)還原酶催化偶氮鍵的打開，這是偶氮染料降解的第一步也是最關(guān)鍵的一步，這一類具有催化偶氮鍵打開使偶氮化合物還原生成芳香胺化合物功能的酶稱為偶氮還原酶。脫色希瓦氏菌Shewanella decolorationis S12是本實(shí)驗(yàn)室從廣州某印染廠廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離純化得到的希瓦氏菌新種，可以表達(dá)細(xì)胞質(zhì)的非特異性偶氮還原酶進(jìn)行厭氧偶氮還原。但是S.decolorationis S12的生長(zhǎng)受溫度影響較為明顯,在高溫如37°C以上或低溫15°C以下，其生長(zhǎng)均不理想。因此需要構(gòu)建一種可以在更廣溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)偶氮染料的脫色的工程菌，其具有更強(qiáng)的脫色活性和長(zhǎng)期的存活能力，并可應(yīng)用于染料廢水的處理
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
:本專利技術(shù)的目的是提供一種可以在更廣溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)偶氮染料的脫色的工程菌，其具有更強(qiáng)的脫色活性和長(zhǎng)期的存活能力，并可應(yīng)用于染料廢水的處理的高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)的高效還原偶氮染料的基因工程菌是通過(guò)以下方法構(gòu)建的，該構(gòu)建方法包括以下步驟，將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動(dòng)子序列與表達(dá)載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，而得到具有雙啟動(dòng)子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR，所述的NADH-偶氮還原酶基因?yàn)镚enebank登錄號(hào)為EF198254所示的核苷酸序列,所述的NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子為Genebank登錄號(hào)為EF647586所不的核苷酸序列。本專利技術(shù)的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR在無(wú)乳糖誘導(dǎo)的條件下即可表達(dá)一定活性的NADH-偶氮還原酶，在乳糖誘導(dǎo)的條件下可高效表達(dá)NADH-偶氮還原酶，其脫色活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET_22b (+),以及基因供體菌株 S.decolorationis S12。因此本專利技術(shù)的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以應(yīng)用于偶氮染料的脫色降解。本專利技術(shù)的選用的質(zhì)粒表達(dá)載體為pET_22b (+)，含有T7啟動(dòng)子和Iac操縱子，可以在乳糖誘導(dǎo)下對(duì)插入的外源基因進(jìn)行高效表達(dá)。本專利技術(shù)選用的原核基因表達(dá)用的宿主菌為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，其染色體上整合有λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，控制表達(dá)T7噬菌體RNA聚合酶，從而可以識(shí)別表達(dá)載體上的T7啟動(dòng)子。本專利技術(shù)提供的高效還原偶氮染料的基因工程菌，可用于環(huán)境污染修復(fù)領(lǐng)域中的偶氮染料廢水的脫色降解。本專利技術(shù)通過(guò)在DNA水平設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，對(duì)S.decolorationis S12基因組中NADH-偶氮還原酶基因(azoR基因，其Genebank登錄號(hào)為EF198254)的開放閱讀框及其上游啟動(dòng)子(其Genebank登錄號(hào)為EF647586)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切后與同樣經(jīng)過(guò)酶切的表達(dá)載體pET-22b (+)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而獲得高效表達(dá)NADH-偶氮還原酶基因(azoR)的基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/azoR。該基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以在更廣溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)偶氮染料的脫色，具有更強(qiáng)的脫色活性和長(zhǎng)期的存活能力，在染料廢水處理方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。 NADH-偶氮還原酶基因供體菌株S.decolorationis S12已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)為CCTCC M203093)和日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(保藏號(hào)為IAM15094T)，并已獲得了國(guó)家專利技術(shù)專利(專利號(hào)ZL200310112361.7)。附圖說(shuō)明:圖1為質(zhì)粒pET_22b (+)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR中的重組質(zhì)粒pET_22b(+)/azoR的DNA及其PCR產(chǎn)物的電泳圖；圖2a中的B:攜帶雙啟動(dòng)子的pET_22b (+) /azoR重組質(zhì)粒；圖2a中的P:pET-22b (+)質(zhì)粒；圖2a中的N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子而沒有表達(dá)pET-22b (+)的T7啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒；圖2a中的E:僅攜帶表達(dá)pET_22b (+)的T7啟動(dòng)子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒。圖2b中的B:pET-22b (+) /azoR重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，圖2b中的N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子而沒有表達(dá)pET-22b (+)的T7啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；圖2b中的E:僅攜帶表達(dá)pET-22b (+)的T7啟動(dòng)子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物。M =DNAMarker (5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp)；圖3為基因工程菌粗酶液的SDS-PAGE電泳圖；其中B:攜帶雙啟動(dòng)子的pET-22b(+)/azoR重組質(zhì)粒的基因工程菌在無(wú)誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；BL:攜帶雙啟動(dòng)子的pET-22b(+)/azoR重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；P:含pET_22b(+)質(zhì)粒的基因工程菌在無(wú)誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；PL:含pET-22b(+)質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子而沒有表達(dá)pET-22b(+)的T7啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的基因工程菌在無(wú)誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；NL:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子而沒有表達(dá)pET-22b (+)的T7啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；E:僅攜帶表達(dá)pET-22b(+)的T7啟動(dòng)子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的基因工程菌在無(wú)誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；EL:僅攜帶表達(dá)pET-22b (+)的T7啟動(dòng)子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子的對(duì)照重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)蛋白；M:蛋白Marker (116D，66.2D, 45D, 35D, 25D, 18.4D, 14.4D)；圖4為不同菌株對(duì)偶氮染料莧菜紅的脫色曲線圖；E azo(L):誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/azoR ；E azo R:無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/azoRo 22b:菌株 E.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+) ；BL21:菌株 E.coli BL21(DE3) ；S12:菌株S.decolorationis S12。no cells:沒有加入任何菌株。具體實(shí)施方式:以下實(shí)施例是本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種高效還原偶氮染料的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將NADH?偶氮還原酶基因及其上游啟動(dòng)子序列與表達(dá)載體pET?22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中，而得到具有雙啟動(dòng)子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli?BL21(DE3)/azoR，所述的NADH?偶氮還原酶基因?yàn)镚enebank登錄號(hào)為EF198254所示的核苷酸序列，所述的NADH?偶氮還原酶基因上游啟動(dòng)子為Genebank登錄號(hào)為EF647586所示的核苷酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種高效還原偶氮染料的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動(dòng)子序列與表達(dá)載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，而得到具有雙啟動(dòng)子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR,所述的NADH-偶氮還原酶基因?yàn)镚enebank登錄號(hào)為EF1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳杏娟，許玫英，孫國(guó)萍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣東省微生物研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：