本發明專利技術公開了一種融合型原核表達載體及其構建方法和應用，包括：啟動子、純化標簽基因、蛋白酶切割位點、多克隆位點和終止子；其中，在純化標簽基因和蛋白酶切割位點之間連接有β2微球蛋白基因。本發明專利技術融合型原核表達載體中帶有β2微球蛋白（β2M）基因，將不易表達的外源蛋白連接在β2M基因的下游，使表達載體在表達不易表達的外源蛋白時能充分利用β2M基因的優良特性，使外源蛋白在宿主細胞中高效表達，且利于后期目標蛋白的復性及分離純化。此外，本發明專利技術融合型原核表達載體中帶有純化標簽和酶切位點，也有利于蛋白表達完成之后的分離純化，也有利于純化標簽以及β2M蛋白的去除，獲得更加接近天然序列的目的蛋白。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種表達載體，尤其涉及一種融合型原核表達載體及其構建方法，本專利技術進一步涉及該融合型原核表達載體在表達外源蛋白中的應用，屬于融合型原核表達載體領域。
技術介紹
自1983年人免疫缺陷病毒(HIV-1)首次從一個全身淋巴結腫大的病人體內分離出來以來，在對病毒生活周期以及HIV-1編碼的九個基因的功能意義的理解上已經取得了巨大的進步。大量的注意力被放在了 HIV-1的四個開放讀碼框Vif，Vpr，Vpu和Nef上。這些基因最初被稱為附屬基因，這些基因產物共同調節宿主細胞生理來利于病毒復制，它們在HIV-1的致病機制中起很大的作用，特別是Vpr蛋白的表達，它導致細胞周期G2期阻滯和細胞凋亡。人免疫缺陷病毒(HIV-1)的病毒蛋白R (Vpr)含有96個氨基酸殘基，分子量大約為14KD，在HIV-1，HIV-2，SIV中高度保守。Vpr對AIDS的致病機理極其重要，研究表明Vpr在病毒復制過程中具有多種功能=1.影響反轉錄過程的準確性；2.作為前整合體復合物的一個組成部分參與病毒DNA轉運至細胞核；3.使被感染細胞的繁殖周期發生G2期阻滯；4.誘導病毒被感染細胞的凋亡；5.與宿主基因共同反式激活HIV-1長末端重復序列(Longterminal r印rat，LRT)。因此，研究HIV病毒的Vpr蛋白對于艾滋病的致病以及發病和后期的治療具有一定的意義。￠2微球蛋白(P2M)基因編碼的是一個只有99個氨基酸組成的小分子蛋白質，現有大量的文獻資料顯示，該基因可以在大腸桿菌中高效表達，可達到總蛋白30%。迄今為止，沒有文獻報道將難以表達的目的蛋白基因融合在P 2微球蛋白基因的下游后進行表達能夠提聞目的蛋白在原核系統中的表達效率。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種融合型原核表達載體，該表達載體能夠將不易表達的蛋白在原核系統中進行高效表達；本專利技術的目的之一是提供一種構建所述融合型原核表達載體的方法；本專利技術的目的之三是將所述融合型原核表達載體應用于在原核系統中表達外源蛋白。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種融合型原核表達載體，包括:啟動子、純化標簽基因、蛋白酶切割位點、多克隆位點和終止子；其中，在純化標簽基因和蛋白酶切割位點之間連接有￠2微球蛋白基因；純化標簽基因位于啟動子的下游，多克隆位點位于蛋白酶切割位點和終止子之間。所述@ 2微球蛋 白基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。所述的啟動子可以大腸桿菌表達體系中常用的啟動子，例如可以是Iac啟動子、trp啟動子'P1啟動子、由Iac啟動子-10區和trp啟動子-35區融合形成的tac啟動子或Tn5啟動子等。所述的純化標簽可以為his標簽、avidin標簽、t7標簽或myc標簽等，優選為his標簽。所述的蛋白酶切割位點的蛋白酶可以為PSP酶、腸激酶或凝血酶等，優選為PSP酶。本專利技術的另一目的是提供一種構建所述融合型原核表達載體的方法，包括:(I)將純化標簽基因、P 2微球蛋白基因、蛋白酶切割位點和多克隆位點依次連接在一起，得到融合基因:(2)將融合基因可操作的與原核表達載體的啟動子和終止子連接在一起，即得；其中，融合基因序列位于原核表達載體的啟動子下游。其中，所述的原核表達載 體可以是pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK、pBAD或pBV220等原核表達載體；優選為pET28a。所述的融合基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示。本專利技術還提供了利用所述融合型原核表達載體生產外源蛋白的方法，該方法包括:將外源蛋白基因可操作的插入到上述融合型原核表達載體中得到含有外源蛋白基因的重組融合型原核表達載體，再將該重組融合型原核表達載體表達載體導入宿主細胞，獲得重組菌株；培養重組菌株，誘導外源基因表達，收集表達產物，分離純化，即得。所述外源蛋白優選為不易表達的蛋白，尤其是多肽、小蛋白或毒性蛋白等，優選為HIV的Vpr蛋白；所述HIV的Vpr蛋白基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。所述的宿主細胞可以是大腸桿菌、芽孢桿菌、藍藻、或衣藻等，優選為大腸桿菌BL21。本專利技術融合型原核表達載體中帶有P 2M基因，將不易表達的外源蛋白連接在3 2m基因的下游，使表達載體在表達蛋白時能充分利用P2M基因的優良特性，使外源蛋白高效表達，并且利于后期目標蛋白的復性及分離純化。同時本專利技術表達載體中帶有的純化標簽和酶切位點，這也有利于蛋白表達完成之后的分離純化，有利于純化標簽以及P2M蛋白的去除，獲得更加接近天然序列的目的蛋白。附圖說明圖1為重組質粒pET- ^ 2M的物理圖譜。圖2為各表達載體在大腸桿菌中表達Vpr蛋白結果；A為陰性對照；B為表達載體pET-0 2M-Vpr在大腸桿菌中表達Vpr蛋白；C、D為表達載體pET_Vpr在大腸桿菌中表達Vpr蛋白。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本專利技術，本專利技術的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本專利技術的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神和范圍下可以對本專利技術技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術的保護范圍內。實施例1含有P 2M基因的表達載體pET- ^ 2M的構建I)合成以下帶有His純化標簽、β 2微球蛋白、腸激酶切位點、多克隆酶切位點的核苷酸序列:CATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGACGACGACGACAAGGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGC (SEQ ID N0.2)2)在引物 1:5’ GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATAT3’ (下劃線部分為 Nco I 識別位點)引物2:5’ GTACGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCG3’ (下劃線部分為 Not I 識別位點)的引導下，以步驟I)中的序列為模板進行PCR，擴增得到帶有NcoI和Not I的以下核苷酸序列:GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTC本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種融合型原核表達載體，包括：啟動子、純化標簽基因、蛋白酶切割位點、多克隆位點和終止子；其特征在于：在純化標簽基因和蛋白酶切割位點之間連接有β2微球蛋白基因；所述β2微球蛋白基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：華權高，馬峰，沈鶴霄，舒芹，易汪雪，
申請(專利權)人：武漢華美生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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