一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達方法及其應用技術

本發(fā)明專利技術屬于生物技術領域，具體涉及一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達方法及其應用。該表達方法利用重組DNA技術以Trx替代重組胰島素及其衍生物A、B鏈之間的C肽、從而有效改善可溶性重組胰島素及其衍生物的基因工程表達產量。該表達方法與低溫表達、多分子伴侶共表達聯(lián)合應用時，能夠顯著提高可溶性重組胰島素及其衍生物的產量。本發(fā)明專利技術還提供了一種可溶性重組胰島素及其衍生物的純化制備方法及其在制備治療糖尿病藥物中的應用。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達方法及其應用
: 本專利技術屬于生物
具體涉及一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達方法及其應用。二、
技術介紹
: 在現(xiàn)代社會，糖尿病是一種發(fā)病率高、并發(fā)癥多且難以根治的慢性疾病。在世界范圍內，糖尿病發(fā)病率都在上升。這種疾病是導致失明、腎衰竭、截肢、心臟病和中風的主要原因。每年因它之而喪命的患者人數(shù)與因艾滋病病毒/艾滋病(HIV/AIDS)而導致的死亡人數(shù)不相上下。目前，我國可能已成為糖尿病患病人數(shù)最多的國家，我國糖尿病成人患者總數(shù)達9240萬，其中農村4310萬，城市4930萬左右，發(fā)病率超過了 10%，糖尿病用藥市場已過百億元。胰島素類藥物是控制和治療糖尿病的不二選擇。按來源分類，有動物胰島素、半合成人胰島素和生物合成人胰島素(現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素)；按藥效時間長短又可分為超短效、短效、中效、長效、預混胰島素。據不完全統(tǒng)計，胰島素市場容量也近60億元，同時每年增速超過20%。2010年，中國已經成為全球糖尿病患病率增長最快的國家之一，增速驚人。僅諾和諾德一家，2009年在中國市場的胰島素銷量就已經超過了 40億元，這個市場不可限量。但國內企業(yè)從這個大蛋糕中只分食到5%的份額。據統(tǒng)計，外資企業(yè)占據了中國胰島素市場95%的份額， 而在重組人胰島素方面，只有通化東寶和甘李藥業(yè)兩家涉足，其主要瓶頸在于胰島素及其衍生物生產工藝的高難度。胰島素及其衍生物分子量6063，由兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個氨基酸，B鏈有32個氨基酸。A-B鏈之間有兩處二硫鍵相連，A鏈自身有一對二硫鍵相連。雖然胰島素及其衍生物已投入生產，但是其純化步驟繁瑣、產量較低的問題一直成為影響胰島素及其衍生物成本的關鍵難題。在經典的原核表達體系中，胰島素及其衍生物由于兩對二硫鍵的存在，常以不溶性的包涵體形式存在。由于大腸桿菌硫氧還蛋白(Trx)具有在大腸桿菌中表達水平高、可溶性能好等特點，已經被美國Novagen公司開發(fā)成為一個常用的融合表達標簽(pET32系列表達載體)，用于提高目標蛋白的可溶性，并且取得了較廣泛的成功應用。已經有科學家嘗試將人胰島素與硫氧還蛋白(Trx)融合表達(張守濤等人，生物技術，2010，20(2):14-16 ;董文甫等人，草食家畜，2006,4:4-6)，但實驗結果表明:硫氧還蛋白(Trx)融合表達的胰島素可溶性依然較差。例如，重慶理工大學范開等人2006年專利技術的可溶性胰島素生產工藝將Trx置于胰島素的N端，在胰島素A、B鏈之間放置了 C肽，因此，在產物后加工工藝環(huán)節(jié)，既需要切除N端的Trx蛋白，又需要切除胰島素A、B鏈之間的C肽，由于使用了具有分子伴侶性質的Trx蛋白質，胰島素的表達水平為20%，可溶性的胰島素占細菌總蛋白的15%。大部分表達的重組胰島素仍然以包涵體形式存在。因此，對于重組胰島素及其衍生物的生產來說，由于去除C肽的后加工環(huán)節(jié)已經成熟，包涵體復性的效率及其成本已經成為重組胰島素及其衍生物生產的關鍵和瓶頸環(huán)節(jié)。有效避免重組胰島素及其衍生物蛋白質在細菌中表達時包涵體的形成，這是國際重組胰島素及其衍生物行業(yè)至今缺乏重大進展的難題。三、
技術實現(xiàn)思路
: 為了有效避免克服重組胰島素及其衍生物生產過程中存在的包涵體復性效率及其成本的難題，本專利技術的目的在于提供一種全新的重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌中可溶性表達的新的表達方法，用于制備重組胰島素及其衍生物。為達到上述目的，本專利技術的技術方案是用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的一種重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達方法。 進一步地，上述用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的一種重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達方法，使Trx兼具胰島素C肽和可溶性融合標簽的雙重功能，從而能夠改善重組胰島素及其衍生物表達產物的可溶性表達。進一步地，上述重組胰島素及其衍生物與多分子伴侶共表達的表達方法，從而顯著提高重組胰島素及其衍生物表達產物的可溶性表達產量。進一步地，一種在低溫下(10-35°c)表達上述重組胰島素及其衍生物的方法。進一步地，一種利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的方法，但是并不局限利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的純化方法。進一步地，一種利用Trx代替C肽，將Trx作為胰島素及其衍生物A、B鏈之間的連接肽使用的重組胰島素及其衍生物在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)可溶性表達的方法在制備重組胰島素及其衍生物藥物中的應用。進一步地，一種利用鋅離子金屬親和層析純化上述重組胰島素及其衍生物的方法所制備可溶性重組胰島素及其衍生物在制備治療糖尿病藥物中的應用。與已有的重組胰島素及其衍生物可溶性表達技術相比，本專利技術的特色和創(chuàng)新之處在于: (1)本技術將Trx放在胰島素及其衍生物A、B鏈之間，既保留了Trx蛋白質的分子伴侶特點，同時又省卻了 C肽，從而只需要一步切割工藝； (2)本技術在選用了Trx的基礎上，采用了低溫發(fā)酵及多分子伴侶共表達技術，使得可溶性的胰島素及其衍生物占細菌總蛋白的28%，78%的表達產物為可溶性產物，顯著提高了可溶性的重組胰島素及其衍生物的表達產量。因此在可溶性表達水平和生產工藝上都有顯著的進步和改善。四附圖說明 圖1.Trx作為連接肽的甘精胰島素表達的SDS-PAGE分析。1:空載質粒pET28a誘導表達的上清；2:空載質粒pET28a誘導表達的沉淀；3:蛋白質標準；4:pET-1NG誘導表達的上清；5:pET-1NG誘導表達的沉淀。圖2.Trx作為連接肽的甘精胰島素與多分子伴侶共表達的SDS-PAGE分析。1:蛋白質標準；2:先誘導表達pET-1NG I小時，再誘導表達pGTF2的表達上清；3:先誘導表達pET-1NG I小時，再誘導表達pGTF2的表達沉淀；4:共轉染ρΕΤ-1NG和pGTF2、但只用IPTG誘導pET-1NG表達的表達上清；5:共轉染pET-1NG和pGTF2、但只用IPTG誘導pET-1NG表達的表達沉淀；6:共轉染pET-1NG和pGTF2、但只用四環(huán)素誘導pGTF2表達的表達上清；7:共轉染pET-1NG和pGTF2、但只用四環(huán)素誘導pGTF2表達的表達沉淀；8:pGTF2誘導表達的上清；9:pGTF2誘導表達的沉淀；10:同時誘導表達pET-1NG和pGTF2的表達上清；11:同時誘導表達pET-1NG和pGTF2的表達沉淀；12:先誘導pGTF2表達I小時，再誘導表達pET-1NG表達的表達上清；13:先誘導pGTF2表達I小時，再誘導表達pET-1NG表達的表達沉淀。圖3目的蛋白中可溶性的Trx作為連接肽的甘精胰島素的產量。1:誘導表達pET-1NG ;:2:先誘導表達pET-1NG I小時，再誘導表達pGTF2 ;3:pET-1NG和pGTF2共轉染、但只用IPTG誘導pET-1NG ；4:同時誘導表達pET-1NG和pGTF2 ；5:先誘導表達pGTF2 I小時，再誘導表達pET-1NG。五具體實施方式 實施例: 1、甘精胰島素表達載體的構建 克隆有甘精胰島素的A鏈(pUC57-A)和B鏈(PUC57-B)的質粒由金斯瑞公司合成和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種可溶性重組胰島素及其衍生物的表達方法，其特征是通過在大腸桿菌中表達一種以Trx替代重組胰島素及其衍生物A、B鏈之間的C肽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：華子春，甘子儀，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發(fā)明
國別省市：