本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體及制備方法，基因轉(zhuǎn)移體的基因序列為：SEQ?ID?No.15，該基因轉(zhuǎn)移體的5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR、人工構(gòu)建的組合啟動子CAG、抑制蛋白基因FSTN、內(nèi)部核糖體進入位點IRES、綠色熒光蛋白AcGFP基因、Rabbit?globin?polyA信號區(qū)；該制備方法包括：構(gòu)建載體pCAG-IRES2-AcGFP1；FSTN基因的獲得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1載體；MAR序列的獲得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1載體；質(zhì)粒載體構(gòu)建及獲得雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體。本發(fā)明專利技術(shù)的基因轉(zhuǎn)移體不僅是潔凈的、安全的基因轉(zhuǎn)移體，而且實現(xiàn)了任意組合的雙基因共表達，通過IRES的重復(fù)利用，實現(xiàn)多基因共表達的目的，為改善雙、多基因控制的形狀如經(jīng)濟性狀提供新的思路和途徑。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
中的基因工程技術(shù)，具體涉及一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體的制備方法。
技術(shù)介紹
在轉(zhuǎn)基因動物中 外源基因的高效表達必須依賴好的表達載體。影響外源基因高效表達的因素很多，如啟動子、甲基化、基因本身結(jié)構(gòu)、插入位點、調(diào)控序列(增強子、絕緣子、核基質(zhì)結(jié)合區(qū))等。CAG啟動子是人工構(gòu)建的組合啟動子，由巨細(xì)胞病毒(the cytomegalovirus,CMV)早期增強子(early enhancer element)和雞 P -肌動蛋白(chicken beta-actin)啟動子組成，CAG啟動子是非特異性的組成型啟動子，用于驅(qū)動基因在哺乳動物載體的高水平表達。CMV是常用的啟動子，在我們轉(zhuǎn)基因羊的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因個體中發(fā)生甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的沉默。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)是真核生物染色質(zhì)中與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的一段DNA序列。MARs參與DNA復(fù)制調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種核生化過程。MA Rs的長度一般為300 — IOOObp，也有的長達幾個kb，維持其活性的最小長度約是300bp，MARs是非編碼序列，AT含量高達70%，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的結(jié)構(gòu)基元，如煙草中發(fā)現(xiàn)TM2序列具備一般MARs序列的基本特征其序列全長lOOlbp，AT含量為62. 8%，序列上含有一個典型的T-box，兩個潛在的DNA解旋序列(AATATT)和一個潛在的拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合位點(CTTTATATTGTTGAC)。研究表明,MARs序列的功能包括邊界因子(boundarye Iement)作用、染色質(zhì)調(diào)節(jié)作用、DNA復(fù)制起始子的組分、染色體結(jié)構(gòu)組成作用、MARS對轉(zhuǎn)基因表達的調(diào)控作用，鑒于MARs與基因表達間的關(guān)系，尤其它能顯著地增強轉(zhuǎn)基因表達、克服位置效應(yīng)、消除轉(zhuǎn)基因沉默，它已被作為一種順式調(diào)控元件應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因技術(shù)中。FSTN，全稱叫卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)ST)又名FSH抑制蛋白，是一種單鏈糖蛋白，最初是從牛和豬的卵泡液中分離出來的，因而被稱作卵泡抑制素。以旁分泌或自分泌的方式，與轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-P)超家族的許多成員，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、肌肉抑素(MSTN)等結(jié)合，其中MSTN是目前所知的最強的骨骼肌生長抑制物。FST蛋白能夠同MSTN黏合在一起，阻斷其抑制功能，從而促進肌肉的生長。IRES序列，內(nèi)部核糖體進入位點序列，真核生物大多數(shù)蛋白質(zhì)合成采用了依賴帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始方式.但一組缺乏帽子結(jié)構(gòu)的RNA病毒的蛋白質(zhì)合成起始是依賴其5'端非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR),即內(nèi)部核糖體進入位點(IRES),該位點是一段高度保守序列，可使其前后基因在同一啟動子下轉(zhuǎn)錄一個雙順反子mRNA，而轉(zhuǎn)譯時使兩基因分別翻譯成兩個獨立的產(chǎn)物。因此，在真核生物轉(zhuǎn)基因表達載體構(gòu)建中，常用于構(gòu)建在一個啟動子下IRES連接兩個基因編碼序列，實現(xiàn)雙順反子共表達。能實現(xiàn)雙順反子共表達的還有I) Fusion基因融合2) cis trans Proteas順反蛋白酶3) Reintiation再開始4)Splicing剪接(基因之間設(shè)計酶切位點5).1nternal Promoter中間啟動子6)手足病病毒2A等。近年來利用去除質(zhì)粒載體主干序列的基因表達盒(僅包括啟動子、編碼區(qū)和終止子)作為基因轉(zhuǎn)移體，也稱為潔凈D N A轉(zhuǎn)化(c I eanDNAt rans f ormat i O n)，主要是通過基因槍轉(zhuǎn)化植物，已在水稻、棉花、小麥、葡萄轉(zhuǎn)化中獲得成功應(yīng)用，利用花粉管導(dǎo)入法在甜瓜中也成功利用，很少見在轉(zhuǎn)基因動物尤其哺乳動物中的構(gòu)建與應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體的制備方法，提供能使兩種目的基因作為雙順反子高效共表達，無質(zhì)粒載體主干序列、無抗性等選擇標(biāo)記、為潔凈和安全性的雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體。本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體，基因轉(zhuǎn)移體的基因序列為SEQ ID NO :15。而且，所述基因轉(zhuǎn)移體從5 '端起到3'端止依次包括有牛核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR、人工構(gòu)建的組合啟動子CAG、抑制蛋白基因FSTN、內(nèi)部核糖體進入位點IRES、綠色熒光蛋白AcGFP 基因、Rabbit globin polyA 信號區(qū)。而且，所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR的序列通過如下引物進行PCR獲得CAG 前的 MAR 序列CMAFl 正義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 9 ；CMAR2 反義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 10 ；PolyA 后的 MAR 序列PMFl 正義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 11 ；PMR2 反義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 12。而且,所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR的序列為SEQ ID No. 13。而且，所述抑制蛋白基因FSTN的序列通過如下引物進行PCR獲得FMFl 正義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 7 ；FMR2 反義鏈，5 ;到 3 ' SEQ ID No. 8。而且，所述抑制蛋白基因FSTN的序列為SEQ ID No. 14。一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體的制備方法，步驟如下第一步，由pCAGEN載體上的CAG啟動子移植并替換pCMV-1RES2_AcGFPl，中的CMV,同時以 pCAGEN 載體上 Rabbit globin polyA 移植并替換 pCMV_IRES2_AcGFPl 中的SV40polyA,構(gòu)建載體 pCAG-1RES2-AcGFPl ；第二步，F(xiàn)STN外源基因的獲得和插入pCAG-1RES2_AcGFPl載體；第三步，MAR序列的獲得和插入pCAG-1RES2_AcGFPl載體；第四步，質(zhì)粒載體pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR 構(gòu)建完畢后，用 Sac1 、Afl II雙酶切，獲得MAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體。而且，所述步驟第一步，進一步的具體步驟包括⑴插入T片段，改變酶切位點從PMD19T-simple vector上獲得T片段，通過酶切位點將該片段連入載體，改變載體上原有酶切位點的順序；(2) CAG啟動子的插入將CAG啟動子從pCAGEN載體上切下，連入到上述載體中；⑶Rabbit globin polyA的獲得和插入從pCAGEN載體上獲得Rabbitglobin polyA序列，通過兩個酶切位點將獲得的Rabbit globin polyA序列插入到載體pIRES2-AcGFPl 中；(4) CMV啟動子的切除將CMV啟動子從載體pIRES2_AcGFPl上切除；(5)補齊pUC后半段根據(jù)pUC的基因序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)獲得pUC序列的后半段，通過兩0000000000個酶切位點將獲得的片段連入到載體PIRES2-ACGFP中，至此，載體pCAG-1RES2-AcGFPl構(gòu)建完畢。 而且，所述步驟第二步，進一步的具體步驟包括⑴依據(jù)FSTNcDNA基因序列設(shè)計引物；⑵通過PCR反應(yīng)獲得FSTN的全長片斷；⑶測序通過膠回收的方法回收該片段,本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種雙順反子共表達基因轉(zhuǎn)移體，其特征在于：基因轉(zhuǎn)移體的基因序列為：SEQ?ID?No.15。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李光鵬，胡曉明，于超然，楊磊，諶顏，扈廷茂，
申請(專利權(quán))人：內(nèi)蒙古大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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